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Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden Struktur-Funktionsuntersuchungen antiviraler Vorläufermedikamente an Thymidylatkinasen (TMPKs) durchgeführt und der katalytische Mechanismus der menschlichen TMPK auf molekularer Ebene untersucht. Die TMPK ist ein essentielles Enzym für die DNA Synthese, da sie am Verbindungspunkt des Erneuerung- und Wiederverwertungsweges der Thymidintriphosphatsynthese lokalisiert ist. In ihrer physiologischen Reaktion katalysiert sie die reversible Phosphorylierung von Thymidinmonophosphat zu Thymidindiphosphat und verwendet dabei Adenosintriphosphat als bevorzugten Phosphoryldonor. Um die Funktionsweise des katalytischen Mechanismus der Thymidylatkinase (TMPK) auf molekularer Ebene aufzuklären, wurden Röntgenkristallstrukturen von Enzym-Nukleotidkomplexen gelöst, die verschiedene Zustände entlang der Reaktionskoordinate der TMPK repräsentieren. Ein Vergleich dieser Strukturen offenbart die Konformationsänderungen des Enzyms und der Nukleotide, die für die Reaktion scheinbar erforderlich sind und läßt die Dynamik der Phosphoryltransferreaktion erahnen. Darüber hinaus wurden ähnliche Experimente mit den partiell aktivierten nukleosidischen anti-AIDS Medikamenten 3´-Desoxy-3´-azidothymidinmonophosphat (AZTMP), 2´,3´-Didesoxy-2´,3´-didehydrothymidinmonophosphat, 3´-Desoxy-3´-fluorothymidinmonophosphat bzw. den Nukleotiden 2´,3´-Didesoxythymidinmonophosphat und 3´-Desoxy-3´-aminothymidinmonophosphat an dem Zielenzym Thymidylatkinase durchgeführt. Die nukleosidischen Reverse Transkriptase Hemmer 3´-Desoxy-3´-azidothymidin (AZT), 2´,3´-Didesoxy-2´,3´-didehydrothymidin (d4T) und 3´-Desoxy-,3´-fluorothymidin (FLT) sind Vorläufermedikamente für die HIV-Therapie, die, nachdem sie in die Zielzellen gelangt sind, von zellulären Enzymen zum Triphosphat phosphoryliert werden müssen, bevor sie ihre antivirale Aktivität ausüben können. Für AZT und FLT ist die zweite Stufe der Aktivierung, die Phosphorylierung des entsprechenden Monophosphates zum Diphosphat durch die menschliche TMPK limitierend, so daß sich die Monophosphate (AZTMP ist toxisch) zellulär zu hohen Konzentrationen anreichern. Die strukturelle Analyse dieser partiell aktivierten Metaboliten im Komplex mit der menschlichen TMPK führten zu einem detaillierten Verständnis der schlechten Phosphorylierungseigenschaften der menschlichen TMPK gegenüber diesen Monophosphaten auf molekularer Ebene. Es scheint, daß für AZT und vermutlich auch für FLT eine Konformationsänderung des Enzyms vor der Reaktion (der Übergang der phosphatbindenden Schleife (P-loop) von einer inaktiven offenen zu einer als aktiv interpretierten (partiell)-geschlossenen Konformation) den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Gesamtreaktion dargestellt und dieses AZTMP und FLTMP zu schlechten Substraten der menschlichen TMPK macht. Basierend auf diese Ergebnisse ist es gelungen, Mutanten der menschlichen TMPK zu entwerfen, die selektiv und effizient AZTMP phosphorylieren und die demnach geeignete Kandidaten für einen gentherapeutischen Ansatz in der HIV-Therapie sind, um die Aktivierung von AZT zu optimieren.