Development of a bacteriophage based product to control colibacillosis in poultry

Abstract

Escherichia coli (E. coli) is part of the commensal microflora of the chicken intestinal tract, being commonly an opportunistic bacteria that causes disease in immunologic deprived chickens. However, there are extra-intestinal E. coli strains, the avian pathogenic Escherichia coli (APEC) that are able to cause colibacillosis by itself, due to its invasive ability. The colibacillosis and colisepticemia are responsible for significant economic losses in poultry industries worldwide, mainly due to the low feed conversion rate with consequent weight loss, high cost of treatments during production, poor carcass quality with consequent rejection at slaughter and high mortalities rates. The increasing high patterns of antibiotic resistance acquired by these bacteria, as well as the restriction to the antibiotic usage implemented by the European Union, have encouraged the search of new solutions to control severe infections ensuring good meat quality and minimizing environmental impact. Bacteriophages (phages), virus infecting exclusively bacteria, have been proposed as valuable alternatives to antibiotics based on their capacity to infect and destroy the bacteria, releasing in few minutes progeny that will infect the surrounding hosts. The presented work aimed at developing an efficient, safe and competitive phage based product to control colibacillosis in poultry. The work encompassed five different stages: firstly, different bacteriophages active for a wide range of APEC strains were isolated and characterized; secondly, an in vivo evaluation of the toxicity of the phage suspensions were performed, thirdly the effect of the route of administration and phage titre on phage dissemination in the chickens’ organisms was assessed; fourthly the efficacy of the phages presenting the wider lytic spectrum was evaluated through in vivo efficiency trials; finally, large animal trials were performed to validate the efficacy of the phage product. Phages were isolated from poultry sewage and tested against 148 O-serotyped APEC strains. The results showed that 70.5% of the tested strains were sensitive to a combination of three of the five isolated phages. Taxonomically, two of these three phages, phi F61E and phi F78E look like 16-19, T4-like phages (Myoviridae) and the other, phi F258E is a T1-like phage and belongs to the Syphoviridae family. All belong to the Caudovirales order. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) patterns demonstrate that all phages were genetically different. The in vivo evaluation of the toxicity of the phage lysate revealed that the phage suspensions did not promote any decrease in feed and water intake, or body weight lost during the in vivo trial and the post mortem necropsies did not show any macroscopic lesions in the internal organs. These observations supported that the lysate was not toxic for chickens. The in vivo assessment of the effect of the route of administration and the dosage in the dissemination of the phages in the chicken’s organs, revealed that when administered orally and by spray, all the phages reached the respiratory tract, as well as the bloodstream. Intramuscular administration enabled the phages to reach all chickens’ internal organs. Results suggested that, besides the intramuscular administration (not feasible to use in flocks), the oral and spray administration can be considered promising administration routes to treat respiratory E. coli infections in poultry. The in vivo evaluation of the efficacy of phi F78E to control severe E. coli infections revealed that phage performance is dosage dependant and only a high concentration of 109 PFU/ml allowed a decrease in 25% and 43% in chickens’ mortality and morbidity, respectively. Interestingly, the phage cocktail (of phi F61E, phi F78E and phi F258E) administered in the water drinking and by spray in a single application, and composed by 5×107 PFU/ml of each bacteriophage, was able to control the mortality rate in naturally infected chicken flocks, refractive to antibiotherapy. The mortality felt from 2.2% in average, to under 0.5% in no more than three weeks, with no recidivism. In conclusion, with this work it was possible to obtain an antimicrobial product, comprised by a combination of three different lytic phages, which demonstrated to be safe for chickens and efficient against colibacillosis in the poultry industry.

A Escherichia coli (E. coli) é uma bactéria que integra a flora intestinal das aves, e que frequentemente se comporta como oportunista, causando doença em aves imunodeprimidas. Contudo, existem estirpes extra-intestinais patogénicas (APEC) que são capazes, pelas suas capacidades invasivas, de causar infecções (colibacilose) que podem degenerar em septicemias. Estas infecções são responsáveis por perdas económicas importantes na indústria avícola, devido a baixas taxas de conversão alimentar com consequentes perdas de peso das aves, elevados custos de tratamento na produção, baixa qualidade da carcaça que leva a rejeições no matadouro e elevadas taxas de mortalidade. O aumento do padrão de resistências a antibióticos adquiridos por estas bactérias, bem como as restrições que a Comunidade Europeia tem vindo a impor no uso destes antimicrobianos, vem relançar a importância do desenvolvimento de alternativas terapêuticas. Os bacteriófagos (fagos), são vírus que parasitam exclusivamente bactérias e que têm vindo a surgir como alternativa valiosa à terapia tradicional. A sua capacidade de infectar e destruir bactérias hospedeiras, libertando nova geração com potencial para infectar os hospedeiros circundantes são características que corroboram a sua valia. O presente trabalho visou o desenvolvimento de um produto à base de fagos para o controlo de colibaciloses na indústria avícola, que se mostrasse eficiente e inócuo e que fosse competitivo. O trabalho compreendeu cinco fases diferentes: em primeiro lugar, bacteriófagos distintos que infectavam uma vasta gama de estirpes APEC foram isolados e caracterizados; seguidamente, foi efectuada a avaliação in vivo da toxicidade da suspensão de fagos; em terceiro lugar, foi testada a influência da via de administração e da concentração de fagos na sua disseminação no organismo das aves; posteriormente a eficiência dos fagos com o espectro de lise mais amplo foi avaliada, através de experimentação in vivo; finalmente foram realizadas experiências em aviários experimentais para validar a eficácia do produto à base de fagos. Os fagos foram isolados de camas de aviários e testados para 148 APEC serotipadas para o antigénio “O”. Destas, 70.5% revelaram-se sensíveis a pelo menos um de três dos fagos. Taxonomicamente, todos os fagos se inserem na ordem dos Caudovirales, sendo que dois deles, o phi F61E e o phi F78E são fagos 16-19, do tipo T4 (Myoviridae) e o outro, phi F258E é um fago do tipo T1 (Syphoviridae). Padrões de RFLP demonstraram que todos os fagos são geneticamente diferentes. A avaliação in vivo da toxicidade do lisado de fagos revelou que a suspensão de fagos não provocou qualquer diminuição na ingestão de alimento e água nem perda de peso, e a avaliação post mortem das carcaças não revelou lesões macroscópicas nos órgãos. Estas observações corroboram a inocuidade do produto, para as aves. As experiências in vivo para analisar o efeito da via de administração e da concentração da suspensão, na disseminação dos fagos no organismo das aves, indicou que quando administrados por via oral e por spray, qualquer dos tipos de fago em teste atingiram o tracto respiratório e a corrente sanguínea. A administração intra-muscular, permitiu que os fagos testados fossem recuperados em todos os órgãos analisados. Os resultados sugerem que, para além da administração intramuscular (modo que não é prático para o maneio em bandos), a administração oral e nasal deverão ser veículos eficientes de transporte de fagos para o tratamento de infecções respiratórias por E. coli em aves. A avaliação in vivo da eficiência do phi F78E para o controlo de infecções severas de E. coli, revelou que o desempenho do fago estava dependente da dose, e que apenas uma concentração elevada, de 109 PFU/ml, permitiu um decréscimo na mortalidade e morbilidade das aves, respectivamente de 25% e 43% em média. Curiosamente, a combinação de fagos (phi F61E, phi F78E e phi F258E), numa concentração de 5×107 PFU/ml cada um, administrado na água de bebida e por spray numa única aplicação, foi eficiente no controlo da mortalidade em bandos naturalmente infectados por APEC, e em que os antibióticos não tinham tido sucesso terapêutico. A mortalidade desceu, em média, de 2.2% para valores inferiores a 0.5% em não mais de 3 semanas, sem recidivas. Em conclusão, este trabalho possibilitou o desenvolvimento de um produto constituído por três fagos, que demonstrou ser inócuo e eficiente no controlo de colibacilose na indústria avícola.