Characterization of a salmonella phage using omic tools and mathematical models to predict host-phage interaction

Abstract

The increasing resistance of pathogenic bacteria to antibiotics in recent years has become a major problem in controlling infections in animals and humans. Salmonella enterica, which causes human food poisoning worldwide, is one of the most problematic bacteria with significant incidence in poultry. The development of alternatives to antibiotics has led to the resurgence of interest in (bacterio)phages, discovered before the antibiotics but which have succumbed to the efficiency of the later. The goal of the work described in this thesis was the biological, genomic and proteomic characterization of a broad host range Salmonella bacteriophage (PVPSE1) with high potential for therapy. It was also aimed at characterizing the population dynamics of the phage‐bacteria system by developing mathematic models that describe host‐phage interaction intended to predict the outcome of a therapeutical use of this phage and also the optimization of phage production. This phage has been proven to be efficient against Salmonella isolated from different sources and also shown the ability to lyse non‐pathogenic E. coli strains. Prior to the characterization steps a new method of phage detection based on the plaque assay was developed in order to enlarge the minimal size plaques formed by PVP‐SE1 which was rendering phage detection and enumeration very difficult. The method was based on the addition of glycerol and antibiotics at sub‐inhibitory concentrations which enabled the improvement of phage plaques size and contrast without changing its efficiency of plating. The phage genome sequencing was determined and a bioinformatic analysis was accomplished. This genomic characterization did not reveal any factor or gene responsible for lysogeny, pathogenesis or other which could exclude the use of this myovirus in vivo. Some of the phage proteins identified during this characterization represent an added value for biotechnological applications. From these, the PVP‐SE1 lysozyme is particularly interesting, not only for its lytic ability against pathogenic bacteria but also for the presence of a peptidoglycan binding domain, an unusual feature among phage lysozymes infecting Gram‐negative bacteria. The identification of the phage tail fibers, which are responsible for bacteria recognition, in such a broad host range Salmonella phage will lead to further investigation in their use to construct a diagnostic tool. Moreover, PVPSE1 was found to be phylogenetically unique, likely leading to the creation of a new phage genus. The mathematical model developed was able to explain the complicate hostphage interaction and allowed a good agreement between the predictions and the experimental data. The model has shown the importance of using a distribution of the latent period in simulations but more importantly it has shown that the bacterial physiological state and bacterial growth rate exerts a major influence in phage production. Due to the ability of the phage to lyse a non‐pathogenic host the possibility of producing the phage in the non‐pathogenic E. coli BL21 was studied. When produced in this alternative host the phage did not modify, maintaining its lytic ability and spectrum among the Salmonella strains. This new approach enables the production of a safer phage product by avoiding the risk of introducing phage resistant pathogenic bacteria in the final product thus diminishing costs of necessary purification techniques. In conclusion, it is presented here the biological, genomic, proteomic and population dynamics characterization of phage PVP‐SE1 which showed to be an added value as a biocontrol agent and as a diagnostic tool for the problematic pathogenic Salmonella. This characterization will be necessary and valuable in the development of a commercial product (therapeutic, diagnostic or other) based on this phage.

O aumento da resistência de bactérias patogénicas aos antibióticos nos últimos anos representa um dos maiores problemas no controlo de infecções em animais e humanos. A Salmonella enterica é uma das bactérias mais problemáticas com grande incidência na produção aviária causando intoxicações alimentares com impacto global em humanos. O desenvolvimento de alternativas aos antibióticos provocou um ressurgimento dos (bacterió)fagos que tinham sido descobertos antes dos antibióticos, mas que rapidamente sucumbiram à eficiência daqueles. O trabalho descrito nesta dissertação teve como objectivo a caracterização biológica, genómica e proteómica de um fago de Salmonella (PVP‐SE1) que apresenta um largo espectro lítico e um grande potencial para terapia. Pretendeuse ainda caracterizar a dinâmica de populações existente entre o fago e a bactéria através do desenvolvimento de modelos matemáticos que descrevessem a interacção entre o fago e a bactéria de forma a prever o resultado do uso terapêutico deste fago e que permitisse a optimização da sua produção. O fago estudado mostrou‐se eficiente contra isolados de Salmonella de diferentes origens e também eficiente contra estirpes de E. coli não patogénicas. A detecção e enumeração deste fago são dificultadas pelas características das suas placas fágicas que apresentam pequena dimensão e baixo contraste. Assim foi imprescindível o desenvolvimento de um novo método que permitisse uma melhor observação das placas fágicas. Essa tarefa foi conseguida através da adição de glicerol e de antibióticos, a uma concentração sub‐inibitória, ao meio de cultura o que permitiu uma melhor visualização das placas fágicas pelo consequente aumento do seu tamanho e contraste sem contudo alterar a eficiência de plaqueamento. O gemoma do fago foi sequenciado e a sequência anotada recorrendo a ferramentas bioinformáticas. A caracterização genómica não revelou a presença de factores ou genes responsáveis por conversão lisogénica, patogénese ou outros que possam excluir o uso in vivo deste myovirus. Algumas das proteínas identificadas aquando da caracterização do fago podem representar uma maisvalia para a biotecnologia. De entre essas proteínas, a lisozima é particularmente interessante não apenas pela sua capacidade lítica contra bactérias patogénicas mas também pela presença de um domínio de ligação ao peptidoglicano que representa uma característica rara nas lisozimas de fagos que infectam bactérias Gram‐negativas. A identificação das fibras da cauda, responsáveis pelo reconhecimento das bactérias a infectar, num fago com tão largo espectro para a Salmonella conduzirá certamente a futuras investigações no seu uso para a construção de uma ferramenta de diagnóstico. De salientar ainda que o fago é filogeneticamente único e provavelmente dará origem à criação de um novo género na classificação dos fagos. O desenvolvimento do modelo matemático apresentado nesta dissertação permite explicar as complicadas interacções existentes entre as populações de fagos e de bactérias permitindo uma boa aproximação entre as simulações e os dados experimentais. A previsão do comportamento resultante do encontro de bactérias e fagos é de extrema importância na aplicação dos fagos como agentes terapêuticos e poderá desempenhar um papel preponderante na produção e optimização de fagos. O modelo revelou a importância de utilizar uma distribuição dos valores do tempo de latência nas simulações mas principalmente mostrou que o estado fisiológico da célula e a taxa de crescimento da bactéria influenciam grandemente a produção de fagos. Devido à sua capacidade para infectar uma bactéria não patogénica foi estudada a possibilidade de produzir o fago na bactéria E. coli BL21. Quando replicado neste hospedeiro alternativo o fago não se alterou, mantendo a sua capacidade e o seu espectro lítico contra as estirpes de Salmonella. Esta nova abordagem permite a produção de um produto fágico mais seguro pela eliminação do risco de introdução de uma bactéria patogénica resistente ao fago no produto final diminuindo assim os custos inerentes aos processos de purificação. Em conclusão, apresenta‐se aqui uma caracterização biológica, genómica, proteómica e de dinâmica de populações de um fago que se provou ser uma maisvalia como agente de controlo e como ferramenta de diagnóstico do agente patogénico Salmonella. Esta caracterização será necessária e valiosa no desenvolvimento de um produto comercial (terapêutico, de diagnóstico ou outro) baseado neste fago tão interessante.