Host-pathogen interactions in Mycobacterium ulcerans infections: implications for the development of new control strategies

Abstract

Mycobacterium ulcerans is the causative agent of Buruli ulcer (BU), a necrotizing disease of the skin, subcutaneous tissue and bone. BU pathogenesis is associated with mycolactone, a lipidic exotoxin with cytotoxic and immunosuppressive properties. The treatment of BU consists of a combination of rifampicin and streptomycin (RS), with successful results for nonulcerative and small ulcers, but variation in efficacy for advanced and disseminated lesions, for which surgery is required. Established BU lesions are histologically characterized by extensive necrotic, acellular areas with clumps of extracellular bacilli surrounded by inflammatory cells, usually neutrophils and macrophages, some containing intracellular bacteria. On the other hand, histological analysis of lesions during or after antibiotherapy revealed a more abundant cellular infiltration and a greater proportion of intramacrophage mycobacteria, suggesting that the immune system collaborates with the antibiotics to clear the infection. On the other hand, some BU patients develop paradoxical reactions to antibiotherapy, characterized by a worsening of the lesions after an initial improvement. These reactions have been associated with exacerbated inflammatory responses to mycobacterial antigens, but are clinically difficult to differentiate from lesions that failed to be cured. Based on these data from the literature, we further characterized the immune response to M. ulcerans during the World Health Organization (WHO) recommended antibiotherapy to BU. For that, we used the mouse footpad model of M. ulcerans infection. Following the emergence of footpad pathology, mice were subjected to a 10 weeks RS treatment. We showed that the rapid elimination of viable M. ulcerans organisms from the footpads is accompanied by a shift in the cellular infiltrates from a predominantly neutrophilic/macrophagic to a more abundant lymphocytic/macrophagic profile with increased phagocyte activation. We additionally observed that antibiotherapy prevents the draining lymph node (DLN) destruction associated with depletion of B and T cells. These data thus suggest that the rapid re-establishment of the host immune response, with the rescue of DLN function, may contribute to the clearance of infection. On the other hand, we also observed that the local footpad inflammatory response persists for a long time after RS treatment, coincident with the presence of poorly-stained acid-fast bacilli (AFB). In humans, BU lesions during or after antibiotherapy also show the persistence of poorlystained AFB, raising the question if the bacilli are dead or in a state of latency, constituting a potential focus of reactivation. We wherein showed that immunosuppression induced by dexamethasone (DEX) administration after RS treatment do not induce reactivation of infection. Therefore, the persistent inflammatory response to mycobacterial antigens observed in our mouse model support the inflammatory nature of the paradoxical reactions during or after antibiotic treatment in BU patients and their unlikely association to treatment failure. The occurrence of paradoxical reactions could be circumvented by immunosuppressive drugs. Therefore, it is important to clarify to what extend the immune system contributes to bacterial clearance during antibiotherapy and if immunosuppression hampers the efficacy of the RS regimen. For that, DEX was administered before experimental infection and maintained during RS treatment. We showed that immunosuppressed mice are more susceptible to M. ulcerans, with higher bacterial burdens and earlier ulceration. However, when mice were subjected to a combined RS/DEX administration, the macroscopic pathology ultimately decreased over time and no viable bacteria persisted. This was observed despite a delayed kinetics in bacterial clearance, associated with a local reduction of T cell and neutrophil numbers. Moreover, extended DEX administration did not result in reactivation of infection. These findings reveal a major role of the RS bactericidal activity for the resolution of M. ulcerans experimental infections, and support the potential safety of corticosteroids for the management of paradoxical reactions in BU patients. Although the RS regimen is very efficient in curing small lesions, the situation changes for more severe cases, and culture positivity after the end of treatment is reported for some BU patients. In these cases, the immune system may play a role in further resolving the infection and therefore the study of mechanisms of immune activation could lead to new immunotherapies complementary to antibiotherapy. Given the potential of macrophages for the intracellular killing of M. ulcerans, namely after activation by interferon gamma (IFNγ), we further uncovered the mechanisms of macrophage activation. We characterized the role of Toll-like receptors (TLRs) 2 and 4 and showed that TLR 2 is highly involved in M. ulcerans recognition of both mycolactoneproducing and mycolactone-deficient strains, since the expression/production of tumour necrosis factor (TNF), interleukin (IL)-6 and IL-10 was hampered in the absence of this receptor. On the other hand, TLR 4 only contributed for IL-10 expression/production. The high participation of TLR 2 in cytokine expression/production was shown to be correlated with the activation of mitogen activated protein kinases (MAPKs), particularly the extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) and the p38 kinase. Mycolactone inhibits the production of cytokines, without major effects on their transcription. We also showed that mycolactone does not impact TLR recognition of M. ulcerans, since the addition of the toxin to wild-type, TLR 2 or TLR 4 deficient macrophages infected with the mycolactone-negative strain did not considerably modify the profile of cytokine expression. Based on these data, we went to further analyze the role of TLR 2 and TLR 4 in vivo, by infecting mice deficient for each TLR with a mycolactone-producing strain of M. ulcerans. However, we did not find differences in the outcome of infection. Collectively, these results suggest that although recognition by TLR 2, and to a lesser extent by TLR 4, contributes to cytokine production by macrophages, these receptors do not play a major role in the course of M. ulcerans infection. This could be due to the immunosuppressive activity of mycolactone or by the existence of compensatory mechanisms. Collectively, the data presented in this thesis contribute to a better understanding of the host- M. ulcerans interactions during the administration of the WHO recommended RS regimen, with implications for the management of paradoxical reactions in BU patients and their distinction from treatment failure. Additionally, these data have the potential to pave the way for future studies addressing immunomodulatory strategies to improve the antibiotic efficacy in the case of BU lesions of difficult sterilization, for instance based on the combinatory use of TLR agonists and antibiotics.

A úlcera do Buruli (BU) é uma doença infeciosa causada pelo Mycobacterium ulcerans, e caracterizada pela necrose da pele, tecido subcutâneo e osso. A patogénese da BU está associada às propriedades citotóxicas e imunossupressoras da exotoxina lipídica micolactona, produzida pelo M. ulcerans. O tratamento recomendado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) para a BU consiste numa combinação dos antibióticos rifampicina e estreptomicina (RS), que apresenta elevada eficácia para lesões não ulcerativas ou úlceras de pequena dimensão. No entanto, a eficácia é varável em lesões avançadas ou disseminadas, para as quais é necessária a intervenção cirúrgica. As lesões da BU são histologicamente caracterizadas pela presença de áreas extensas de necrose co-localizadas com grumos de bacilos extracelulares, e infiltrados inflamatórios à periferia onde predominam neutrófilos e macrófagos com alguns bacilos intracelulares. Por outro lado, a análise histológica de lesões durante ou após antibioterapia revelou a presença de um infiltrado inflamatório mais abundante e de uma maior proporção de bacilos fagocitados por macrófagos, sugerindo que o sistema imunitário colabora com os antibióticos na resolução da infeção. No entanto, alguns doentes com BU desenvolvem reações paradoxais durante ou após o tratamento antibiótico, caracterizadas pelo agravamento das lesões após uma melhoria inicial. Estas reações têm sido associadas a respostas inflamatórias exacerbadas a antigénios micobacterianos, e são clinicamente difíceis de distinguir de lesões não esterilizadas pelos antibióticos. Com base nestes dados na literatura, fomos caracterizar a resposta imunitária ao M. ulcerans durante e após o tratamento antibiótico recomendado pela OMS. Para tal, usámos o modelo experimental de infeção da pata no ratinho. Após o surgimento de patologia, os ratinhos foram sujeitos ao tratamento com RS durante 10 semanas. Verificou-se que uma rápida eliminação dos bacilos viáveis na pata foi acompanhada pela alteração do infiltrado predominantemente neutrofílico/macrofágico para um infiltrado mais abundante e predominantemente linfocítico/macrofágico. Além disso, verificou-se um aumento da ativação dos macrófagos. O tratamento antibiótico também preveniu a destruição do nódulo linfático que drena o local de infeção (DLN) e a depleção dos linfócitos B e T. Estes resultados sugerem que o xiii rápido restabelecimento da resposta imunitária, acompanhada da recuperação funcional do DLN, contribui para a resolução da infeção. Por outro lado, verificou-se que a resposta inflamatória persistiu durante muito tempo após o tratamento com RS, coincidente com a presença de bacilos álcool-ácido resistentes (AFB) mal corados. Nos doentes com BU, AFB mal corados também persistem nas lesões durante ou após o tratamento antibiótico. Este facto levanta as hipóteses de os bacilos estarem mortos ou, alternativamente, num estado de latência, podendo assim constituir um foco potencial de reativação da infeção. Aqui demostrámos que a imunossupressão induzida pela administração de dexametasona (DEX), após o tratamento com RS, não induz reativação. Assim, a persistência de uma resposta inflamatória dirigida aos antigénios micobacterianos, conforme observado no nosso estudo, suporta a origem inflamatória das reações paradoxais durante ou após o tratamento e a sua improvável associação com a ineficácia do regime de RS. A ocorrência de reações paradoxais pode ser controlada através da administração de fármacos imunossupressores. Portanto, torna-se importante clarificar até que ponto a resposta imunitária contribui para o controlo da infeção durante o tratamento com RS, e se a imunossupressão afeta a sua eficácia. Para tal, a administração da DEX foi iniciada antes da infeção experimental e mantida durante o tratamento com RS. Verificou-se que os ratinhos imunossuprimidos foram mais suscetíveis à infeção por M. ulcerans, apresentando uma maior carga bacteriana e ulceração mais precoce. Por outro lado, quando os ratinhos foram administrados com uma combinação de RS e DEX, a patologia macroscópica da pata acabou por diminuir ao longo do tempo e não se verificou a persistência de bacilos viáveis, apesar de uma eliminação mais demorada, associada a uma redução do número de células T e neutrófilos. Adicionalmente, o prolongamento da administração da DEX não resultou na reativação da infeção. Estes resultados mostram que a atividade microbicida da RS tem um papel preponderante na resolução de infeções experimentais por M. ulcerans, e apoiam o potencial uso de corticosteroides para o tratamento das reações paradoxais nos doentes com BU. Apesar de a RS ser eficaz no tratamento de pequenas lesões de BU, o panorama é diferente nas lesões mais severas, em que é detetada a presença de bacilos viáveis após antibioterapia. Nestes casos, o sistema imunitário pode ter um papel importante na resolução da infeção durante a administração dos antibióticos, pelo que o estudo dos mecanismos de ativação imune poderá resultar em imunoterapias, complementares à antibioterapia. Tendo em consideração o papel dos macrófagos na eliminação de M. ulcerans intracelular, nomeadamente após a ativação pelo interferão gamma (IFNγ), fomos estudar outros mecanismos de ativação. Assim, caracterizámos o papel dos recetores Toll-like (TLRs) 2 e 4 e demostrámos que o TLR 2 está muito envolvido no reconhecimento de estirpes de M. ulcerans produtoras e não produtoras de micolactona, uma vez que a produção do fator de necrose tumoral (TNF), interleucina (IL)-6 e IL- 10 foi fortemente afetada na ausência deste recetor. A elevada participação do TLR 2 na expressão/produção de citoquinas esteve correlacionada com a ativação de proteínas mitogen activated protein kinases (MAPKs), nomeadamente extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) e p38 kinase. Estudos anteriores demostraram que a micolactona inibe a produção de citoquinas sem que ocorram efeitos significativos na sua transcrição. Neste trabalho, verificou-se que a micolactona não inibe o reconhecimento do M. ulcerans pelos TLRs, uma vez que o perfil de expressão de citoquinas não é substancialmente alterado com a adição desta toxina a macrófagos controlo ou deficientes no TLR 2 ou TLR 4 e infetados com uma estirpe de M. ulcerans não produtora de micolactona. Com base nestes dados, fomos seguidamente analisar o papel do TLR2 e 4 na infeção de ratinhos com uma estirpe de M. ulcerans produtora de micolactona. No entanto, não encontrámos diferenças na progressão da infeção. Estes resultados sugerem que, apesar do reconhecimento do M. ulcerans mediado pelo TLR 2, e com uma menor participação do TLR 4, contribuir para a produção de citoquinas pelos macrófagos, estes recetores não têm um papel muito importante na progressão da infeção por M. ulcerans. Este facto pode ser devido à atividade imunossupressora da micolactona ou à existência de outros mecanismos compensadores. Em suma, os resultados apresentados nesta dissertação contribuem para uma melhor compreensão das interações hospedeiro-M. ulcerans durante o tratamento com RS recomendado pela OMS, com implicações para o tratamento das reações paradoxais nos doentes com BU e a sua distinção dos casos em que o antibiótico é ineficaz. Adicionalmente, estes resultados permitem iniciar futuros estudos, que abordem estratégias imunomodulatórias para melhorar a eficácia dos antibióticos no tratamento das lesões de difícil esterilização, como por exemplo o uso combinado de agonistas de TLRs e antibióticos.