Molecular engineering approaches for the Gup1p and its molecular partners purification and identification

Abstract

S. cerevisiae GUP1 was initially associated to glycerol uptake through an active system. This, since its deletion caused defects on glycerol-mediated salt-stress recovery and on the glycerol/H+ uptake Vmax. Over the last decade, several phenotypes for Δgup1 strain have been reported, suggesting that Gup1p is involved in a wide range of crucial processes for cell preservation and functioning. These include cytoskeleton polarization and endocytic/secretory pathway, GPI-anchor remodelling, cell wall and membrane composition and integrity, and apoptotic process. In Candida albicans, an opportunistic fungal pathogen, the deletion of this gene interferes crucially on its virulence, preventing the transition to filamentous growth, the ability of adhesion, invasion, and biofilm formation. Moreover, the lack of Gup1p promotes an increased resistance to the common antifungals. GUP1 is member of the super family of membrane-bound -O-acyl transferases, with close homologues in higher eukaryotes. Mammalian GUP1 has been identified as negative regulator on the Hedgehog signalling pathway. This pathway, in mammals, plays a key role in cell differentiation during embryogenesis, and its malfunction may cause various types of diseases, including cancer. Based on that, the aim of this work concerned the identification of molecular partners of Gup1p on a possible morphogenic pathway in yeast, similar to Hedgehog in mammals. It was attempted the expression of Gup1 protein in E. coli BL21(DE3)-CodonPlus- RIL utilizing the pET expression systems as well as in S. cerevisiae null mutant strain using pYES plasmids tagged to a reporter protein GFP and also to a Histidine tag. Despite of the use of high number of conditions and optimizations, the expression of Gup1p in E. coli was never attained. On the other hand, using a chimera construction with GFP as reporter gene, the expression in S. cerevisiae Δgup1 mutant strain was reached and therefore, this system was used in subsequent immunoprecipitation assays, which are still being developed and optimized.

O gene GUP1 de S. cerevisiae foi inicialmente associado ao transporte ativo de glicerol. Este gene, quando deletado causa defeitos no transporte do glicerol em situações de stress, assim como na Vmáx do transporte de glicerol. Durante a última década, foram atribuídos vários fenótipos à estirpe Δgup1, sugerindo que a proteína Gup1 está envolvida em diversos processos cruciais para o funcionamento e preservação das células. A proteína Gup1 foi descrita como interferido em processos associados à polarização do citoesqueleto e à composição da membrana e da parede celular, em conexão com as vias de sinalização da secreção e/ou endocitica, à remodelação das âncoras GPI, assim como a processos de apoptose. Em Candida albicans, um fungo patogénico oportunista, a supressão deste gene interfere crucialmente na sua virulência, impedindo a transição para o crescimento filamentoso, interferindo na capacidade de adesão e de invasão, e na formação de biofilmes. Além disso, a deleção do gene GUP1 aumenta a resistência aos antifúngicos comuns. O gene GUP1 é membro da família das O-aciltransferases, com homólogos próximos em eucariotas superiores. O gene GUP1 em mamíferos foi identificado como regulador negativo da via de sinalização Hedgehog. Esta via, nos mamíferos desempenha um papel fundamental na diferenciação celular durante a embriogénese, e o seu mau funcionamento pode causar vários tipos de doenças, incluindo o cancro. Tendo isto em conta, o objetivo do presente trabalho pretendia identificar os possíveis parceiros moleculares da proteína Gup1, numa eventual via morfogénica de leveduras, semelhante à via Hedgehog dos mamíferos. A expressão da proteína Gup1 em S. cerevisiae Δgup1 foi testada usando os plasmídeos pYES ligados à proteína repórter GFP e a uma cauda de histidinas, assim como em E. coli BL21(DE3)CodonPlus-RIL utilizando os plasmídeos pET. Foram experimentadas diferentes condições para obter a expressão da proteína Gup1 em E. coli, contudo não se obteve expressão. Por outro lado, a expressão da proteína Gup1 em S. cerevisiae Δgup1 foi obtida a partir da quimera GUP1-GFP. E como tal, este sistema foi utilizado nos ensaios subsequentes de imunoprecipitação, que se encontram presentemente em fase de desenvolvimento e otimização.