Control of Streptococcus pneumoniae virulence by manipulation of the genetic sequence of virulence factor pneumolysin

Abstract

Streptococcus pneumoniae is one of the most important pathogens of humans. It produces a toxin, pneumolysin (PLY), able to form extraordinarily large pores in the membrane of attacked cells, for which they are dependent on the presence of membrane cholesterol. Murine models of acute pneumonia have shown that PLY is essential for the survival of pneumococcus in both the upper and lower respiratory tracts, as well as it is required for bacterial spread from the lungs to the bloodstream. Besides colonization and invasive disease, PLY has a role in immunogenic protection response. It has been proposed as a strong serotype-independent vaccine candidate. In this thesis, we demonstrate that manipulation of 5’ mRNA folding free energy (ΔG) by introduction of synonymous (silent) mutations allows for projected changes in PLY translation by pneumococcus without the need for chemical inducers or heterologous promoters. Hence, we created a panel of isogenic strains differing only in a few silent mutations at the 5’ end of the ply mRNA that are predicted to alter ΔG by a wide range. In vitro, such manipulation allows rheostat-like control of PLY production and alters the cytotoxicity of whole S. pneumoniae on primary and immortalized human cells. We demonstrate that production of PLY increases due to faster translation initiation with unchanged mRNA stability and decay. In vivo virulence was assessed using a mouse model in which we show differential outcome of pneumococcal pneumonia according to the 5’ mRNA ΔG. Inflammation features on lung histology and proinflammatory cytokine profile both positively and significantly correlate to PLY expression. This strategy of rheostat control of virulence factors is useful and provides proof-ofprinciple as a new tool for understanding the role of specific factors upon host-bacterial interactions. Further research on mRNA ΔG manipulation is a resourceful tool in the study of bacterial pathogenesis.

Streptococcus pneumoniae é um dos agentes patogénicos mais importantes de humanos. Produz uma toxina, pneumolisina (PLY), capaz de formar poros extraordinariamente largos nas membranas de células atacadas, efeito para o qual é dependente da presença de colesterol membranar. Modelos de pneumonia aguda em ratinho mostraram que a PLY é essencial para a sobrevivência do pneumococo tanto no trato respiratório superior como inferior, assim como é requerida para a passagem bacteriana dos pulmões para a corrente sanguínea. Além de colonização e doença invasiva, a PLY tem um papel na resposta imunitária protetora. Tem sido proposta como forte candidata a vacina independente de serotipos. Nesta tese, demonstramos que a manipulação da energia livre de folding (ΔG) de mRNA 5’ por introdução de mutações sinónimas (silenciosas) permite alterações projetadas da tradução de PLY pelo pneumococo sem necessidade de indutores químicos ou promotores heterólogos. Então, criámos um painel de estirpes isogénicas diferindo apenas em poucas mutações silenciosas no terminal 5’ do mRNA de ply que se prevê alterem a ΔG por uma grande margem. In vitro, tal manipulação permite controlo como reóstato da produção de PLY e altera a citotoxicidade de S. pneumoniae em células humanas primárias ou imortalizadas. Demonstramos que a produção de PLY aumenta devido a início de tradução acelerado com estabilidade e decaimento de mRNA inalterados. Virulência in vivo foi avaliada usando o modelo em ratinho no qual mostramos resultados diferenciados de pneumonia pneumocócica de acordo com ΔG do mRNA 5’. Marcadores de inflamação em histologia pulmonar e perfil de citocinas proinflamatórias ambos correlacionam positiva e significativamente com a expressão de PLY. Esta estratégia de controlo reóstato de fatores de virulência é útil e providencia prova de princípio de uma nova ferramenta para a compreensão do papel de fatores específicos durante interações hospedeiro-bactéria. A contínua investigação em manipulação de ΔG do mRNA é uma engenhosa arma no estudo da patogénese.