Application of antisense oligonucleotides to prevent Candida albicans infections

Abstract

Candida albicans is the main cause of candidiasis and its pathogenicity is supported by a series of virulence factors, including the switch from yeast to filamentous forms. The transcription factor EFG1 plays a central role in C. albicans regulation morphology. In addition, there is rise of C. albicans multidrug resistance accompanied by the scarcity of new classes of fungal drugs. Antisense oligonucleotides (ASOs) can hold great promise as a therapeutic agent, however yet they are poorly explored for controlling Candida infections. Therefore, the main goal of this work was to develop a therapeutic approach based on antisense therapy (AST) to track C. albicans filamentation. To this end, two major objectives were addressed: I) Exploitation and application of ASOs to control C. albicans filamentation; II) Creation of strategies for ASOs cargo and delivery. The first goal of this research was the exploitation of the second and third generations of ASOs to control EFG1 gene and C. albicans filamentation. To this end, the anti-EFG1 2’OMethylRNA was firstly projected based on second generation of ASOs and was proved to have an impact on the reduction of EFG1 gene expression (by 60 %) and on Efg1p protein translation (by 60 %). Interestingly, the ASO was able to inhibit filamentation and to attenuate the virulence of C. albicans on in vivo Galleria mellonella (increasing its survival on 30 % at 72h with a double-dose administration). Based on the third generation of ASOs, a set of anti-EFG1 LNA (Locked nucleic acids) ASOs were developed, and their performance was tested in vitro and in vivo. All LNA-ASOs were able to reduce EFG1 gene expression (by 40-80 %) and consequently filamentation (by 45-55 %) in vitro. The in vivo results revealed that the LNA-ASO modified with PS-linkages and palmitoyl-2’-amino-LNA as the most favorable for an in vivo application (increasing G. mellonella survival by 40 % only with a single-dose administration). The second goal of this research was the development of strategies for anti-EFG1 ASO cargo and delivery. Two distinct approaches were tested: (i) development of polyplexes based on polyamide 4 and 6, that revealed to be feasible carriers, once the ASO maintains its activity against C. albicans cells; (ii) application of lipid-based formulations, where the DOTAP/DOPC 80/20 ρ=3 revealed to be the most promising when tested in a G. mellonella model (25 % of increase on larvae survival in comparison to ASO-free at 72 h). In summary, this research underlines the therapeutic potential of ASOs for controlling C. albicans virulence determinants, as is the case of EFG1 gene, as well as the importance of developing carriers’ systems for ASOs cargo. Considering the future research into the management of C. albicans infections, this research provides valuable information to the development of a credible and alternative method to control C. albicans infections, based on AST.

Candida albicans é uma das principais causas de candidíase e a sua patogenicidade é suportada por um conjunto de fatores de virulência, incluindo a capacidade de filamentar. EFG1 é um fator de transcrição com papel fundamental na filamentação. O aumento da multirresistência de C. albicans é acompanhado pela escassez de novos antifúngicos. Os oligonucleotídeos de antisense (OAS) têm revelado potencial como agentes terapêuticos, contudo ainda pouco explorados no controlo da candidíase. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi desenvolver uma abordagem terapêutica baseada na Terapia Antisense (TA) para controlar a filamentação de C. albicans. Para tal, dois grandes objectivos complementares foram definidos: I) Exploração e aplicação de OAS para controlar a filamentação e II) Criação de estratégias para o transporte e entrega dos OASs. Como primeiro objetivo explorou-se a segunda e terceira gerações de OASs para controlar o gene EFG1. O anti-EFG1 2’OMethylRNA foi projetado com base na segunda geração, e provou ter um impacto na redução da expressão do gene EFG1 (em 60 %) e na tradução da proteína Efg1p (em 60 %). O OAS foi capaz de inibir a filamentação e atenuar in vivo a virulência de C. albicans em Galleria mellonella (30 % de aumento de sobrevivência às 72 h após dupla administração). Por outro lado, um conjunto de OAS modificados com LNA (terceira geração) foram desenvolvidos e testados in vitro e in vivo. In vitro, os OAS-LNA inibiram a expressão do gene de EFG1 (em 40-80 %) e a filamentação (em 45-55 %). In vivo, o OAS-LNA com as modificações de PS e palmitoyl-2’amino-LNA revelou ser o mais favorável (40 % de aumento de sobrevivência da G. mellonella com uma administração). Como segundo objetivo exploraram-se poliplexos e lipoplexos como estratégias para o transporte e entrega do anti-EFG1 2’OMe. Como primeira abordagem, desenvolveram-se poliplexos à base de poliamida 4 e 6, que revelaram ser veículos viáveis, uma vez que o OAS manteve a sua atividade contra as células de C. albicans. Em seguida, foram exploradas formulações lipídicas, sendo que o DOTAP/DOPC 80/20 ρ=3 revelou ser a mais promissora quando testada in vivo (25 % de aumento de sobrevivência da G. mellonella em comparação com o OAS livre às 72 h). Em suma, esta investigação destaca o potencial terapêutico de OAS para o controlo de determinantes de virulência de C. albicans, como o caso do gene EFG1, bem como a importância do desenvolvimento de sistemas de veículos para o seu transporte. Considerando futuros trabalhos sobre o controlo de infeções por C. albicans, esta investigação fornece informação valiosa para o desenvolvimento de um método credível e alternativo para o controlo destas infeções, com base na TA.