Caracterização funcional de mutantes da proteína NS3hel do vírus da dengue e expressão do domínio RdRp da proteína NS5 para estudos de interação
Resumo
Resumo : A dengue atualmente constitui um dos principais problemas de saúde pública nas regiões tropicais e subtropicais. Apesar dos grandes avanços dos últimos anos para o entendimento da biologia do vírus da dengue (DENV), a patogenia da doença continua sendo um grande desafio. Estudos de infecção em modelo murino identificaram variantes de alta virulência em dengue vírus tipo 1 (DENV-1) que apresentam mutações nas proteínas E e NS3. As mutações na proteína NS3 encontram-se nos resíduos Val209Ile, Leu435Ser e Leu480Ser do domínio helicase. Recentemente, estudos do nosso grupo demonstraram que as mutações Leu435Ser e Leu480Ser aumentam a capacidade replicativa do DENV-1 in vivo, in vitro e ex vivo, enquanto a mutação Val209Ile parece não alterar a atividade biológica do vírus. Os mecanismos pelos quais as mutações modulam a virulência do vírus ainda não foram completamente compreendidos. A proteína NS3 é uma proteína multifuncional que, juntamente com a proteína NS5, desempenha papel crítico durante a replicação do genoma viral. Buscando um melhor entendimento dos mecanismos funcionais relacionados às mutações, o presente estudo visou expressar e purificar as proteínas NS3hel parental do DENV-1 e suas variantes a fim de avaliar o efeito das mutações pontuais na atividade de ATPase da proteína. Além disso, procuramos expressar o domínio NS5RdRp da proteína NS5 para estudos futuros de interação com a proteína NS3hel. Nossos dados revelam que as mutações em estudo conferem maior afinidade da proteína pelo substrato e maior eficiência catalítica quando comparadas com a proteína parental. Os resultados sugerem ainda que a atividade helicase da proteína NS3hel é estimulada pela molécula de dupla fita de RNA. Pelos métodos empregados neste estudo, não foi possível expressar de forma funcional a proteína recombinante NS5RdRp. No entanto, sob condições desnaturantes a proteína foi purificada e poderá ser utilizada para o desenvolvimento de anticorpos monoclonais, que contribuirão para estudos futuros. Os dados obtidos sobre a atividade ATPase da proteína NS3hel são indicativos de que mutações pontuais podem modular a eficiência catalítica da enzima e modificar a aptidão viral para suportar a infecção do DENV-1 em diferentes modelos de estudo. Tais informações são importantes para o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na patogênese da dengue, os quais são fundamentais no contexto de produção de vacinas efetivas e delineamento de estratégias antivirais
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