Primaire cultuur van proximale tubuluscellen van de muis: cytosolaire calcium in functie van hormoonstimulatie

Abstract

Calcium (Ca2+) vervult als universeel signaalmolecule een belangrijke rol in talrijke cellulaire processen. Hiervoor is het noodzakelijk dat de intracellulaire Ca2+-concentratie ([Ca2+]i) strikt gereguleerd wordt. Veel hormonen oefenen hun effect uit door de concentratie van dit belangrijke ion te beïnvloeden. In de proximale tubulus van de nier werken de hormonen bradykinine (BK) en angiotensine II (AngII) via een intracellulaire Ca2+-stijging. Eerder onderzoek heeft geleid tot de ontwikkeling van primaire culturen waarbij proximale tubuluscellen van de muis gegroeid worden op membranen. Met licht- en elektronenmicroscopie werden de culturen morfologisch gekarakteriseerd. Dit onthulde een kasseisteenachtige monolaag van gepolariseerde cellen. De aanwezigheid van typische epitheliale kenmerken zoals apicale microvilli, talrijke organellen, tight junctions aan de apicale pool en basolaterale invouwingen, werd geobserveerd. In deze studie werden de primaire culturen eerst functioneel gekarakteriseerd. De aanwezigheid van het brushborder enzyme, γ-glutamyltransferase, een merker van proximale tubuluscellen, werd getest om de identiteit van de cellen te achterhalen. Vervolgens werd in confluente culturen de intracellulaire Ca2+-homeostase bepaald met behulp van microfluorescentietechnieken en werden veranderingen in [Ca2+]i geregistreerd met de Ca2+- gevoelige fluorescente probe, Fura-2/AM. De metingen werden uitgevoerd zowel in basale omstandigheden als na stimulatie met BK en AngII. Ook het effect van cadmium (Cd) op de intracellulaire Ca2+-homeostase werd bestudeerd door de primaire culturen gedurende 24 uur bloot te stellen aan 100 nM of 1 μM CdCl2. De basale [Ca2+]i-niveaus en de hormonale responsen werden vergeleken tussen twee in vitro systemen, de primaire culturen en vers geïsoleerde proximale tubuli. De resultaten toonden dat de basale [Ca2+]i in vers geïsoleerde proximale tubuli significant hoger was dan in de primaire culturen. Stimulatie met BK resulteerde in een snelle, transiënte stijging in Ca2+, gevolgd door een tragere stijging die maximaal was na stimulatie met 1 nM BK. Blootstelling aan AngII (0,1 μM en 1 μM) veroorzaakte een trage stijging in [Ca2+]i. De hormonale responsen in de primaire culturen en vers geïsoleerde proximale tubuli waren niet significant verschillend. Preliminaire experimenten met Cd (1 μM) toonden een daling in [Ca2+]i van 33%. Verdere studies zijn nodig om dit te onderzoeken. Deze studie toont dat de primaire culturen van proximale tubuluscellen van de muis functioneel gekarakteriseerd worden door de aanwezigheid van AngII- en BK-receptoren, zoals in vivo.