Identification de causes génétiques des malformations capillaires (CM)

Malformation capillaire est un terme générique qui décrit une lésion cutanée ou muqueuse congénitale qui se présente comme une macule de couleur rose à rouge pouvant se situer n’importe où sur le corps. Cette « tache » est constituée de capillaires et de veinules post-capillaires dilatés avec un endothélium aplati. Les malformations capillaires comptent parmi les malformations vasculaires qui font partie du registre des anomalies vasculaires congénitales. Ces lésions sont présentes dès la naissance, augmentent en taille proportionnellement avec le patient et ne régressent jamais d’elles-mêmes. Elles peuvent être sporadiques ou familiales ainsi que isolées, combinées ou syndromiques. De ce fait, de nombreux phénotypes sont possibles rendant le diagnostic clinique difficile. L’imagerie (surtout l’échographie et la résonance magnétique) ainsi que l’histologie et plus récemment la génétique offrent une aide précieuse. Les malformations vasculaires sont, en règle générale, complexes à traiter et des complications potentiellement graves peuvent survenir. Les traitements interventionnels proposés comprennent le laser à colorant pulsé, la sclérothérapie, l’embolisation et la chirurgie. La guérison de ces syndromes étant rarement complète, le but de ces traitements est d’améliorer la qualité de vie des patients. C’est dans ce contexte de challenge diagnostique et thérapeutique que la génétique trouve sa place. Suite à de longues années de travaux génétiques, il est devenu clair que la plupart des anomalies vasculaires sont dues à des mutations génétiques, soit germinales soit somatiques. Il est maintenant connu qu’une mutation post-zygotique en mosaïque, activatrice avec gain de fonction, dans les gènes GNAQ, GNA11, PIK3CA ou AKT1 provoque des malformations capillaires sporadiques. Dans ce cas, la pathologie se manifeste dès qu’un des deux allèles est muté. Les lésions familiales sont causées par une mutation germinale héritée et une mutation « second hit » somatique post-zygotique, entraînant une perte de fonction, dans les gènes PTEN ou RASA1. Dans ce cas, la pathologie se manifeste lorsque les deux allèles sont mutés. Toutes ces mutations ont comme conséquence une activation constitutionnelle de la voie de signalisation des MAPK ou de la voie de signalisation PI3K/AKT/mTOR menant à la formation des lésions. Sur base de ces connaissances, des panels de gènes connus comme pouvant être impliqués dans les pathologies avec malformation capillaire ont été créés. Aux Cliniques Universitaires Saint-Luc, un panel NGS germinal testant 43 gènes et un panel NGS somatique testant 26 gènes sont utilisés pour poser un diagnostic précis, en fonction du gène muté, des malformations vasculaires. Grâce à la compréhension des mécanismes cellulaires dérégulés par les mutations causales, des traitements moléculaires ciblés et personnalisés sont développés. Ceux-ci consistent en l’inhibition sélective d’un des effecteurs de la voie de signalisation concernée par la mutation et ce, en aval de la protéine présentant une activation constitutionnelle. Il en découle un effet antiprolifératif dans les tissus atteints permettant de réduire la taille des lésions mais également dans les tissus sains induisant des effets secondaires. Plusieurs molécules existent mais nécessitent des essais cliniques pour déterminer leur sécurité à long terme, leur efficacité et les doses à administrer pour le traitement. Le sirolimus (inhibiteur de mTOR) est préféré pour les essais cliniques dans les malformations vasculaires (étude « VASE » en cours de réalisation) car, étant déjà disponible sur le marché, sa sécurité est établie. L’objectif de ce mémoire a été de mettre au point une technique de détection de mutations causales des malformations capillaires sporadiques par PCR allèle spécifique. L’autre versant de ce travail a concerné la recherche de nouveaux gènes impliqués dans les malformations capillaires familiales par test de co-ségrégation et analyse fonctionnelle. La mise au point des PCR allèle spécifique a permis d’obtenir des résultats probants pour la détection des mutations GNAQ c.625C>G (p.Q209E) ; GNAQ c.626A>G (p.Q209R) ; GNA11 c.547C>T (p.R183C) ; PIK3CA c.1624G>A (p.E542K) ; PIK3CA c.1633G>A (p.E545K) et PIK3CA c.3140A>G (p.H1047R). Des échantillons ont été analysés avec succès pour la mutation GNAQ c.548G>A (p.R183Q) et d’autres pour la mutation GNAQ c.626A>G. Une PCR allèle spécifique en multiplex pour la recherche de la mutation GNA11 c.547C>T avec la mutation GNAQ c.625C>G a été concluante. Toutefois, l’analyse d’échantillons avec cette association a été ininterprétable. Cette technique est intéressante car elle permet une détection rapide et peu coûteuse de mutations « hot-spots » connues dans les malformations capillaires sporadiques permettant un diagnostic génétique précis. Une analyse par test de co-ségrégation a été réalisée pour sept changements d’intérêt dans les gènes EPHB4, NOTCH4 et NOTCH1 au sein de sept familles. Ceux-ci ont été trouvés chez les cas index par NGS puis sélectionnés par des filtres bioinformatiques (logiciel Highlander dans le groupe GEHU). Les changements c.1831G>A (p.D611N) et c.447_448insGAAG (p.R150efs*74) dans le gène EPHB4 co-ségrègent avec les lésions tout comme le changement c.2443T>G (p.C815G) dans le gène NOTCH4 et des changements c.2728G>A (p.D910N) et c.6359G>A (p.R2120H) dans le gène NOTCH1. Cela montre leur potentiel rôle causal dans les malformations capillaires familiales. À l’inverse, les changements c.4028C>T (p.A1343V) et c.4049G>T (p.R1350L) du gène NOTCH1 se sont avérés être des polymorphismes puisqu’ils ne co-ségrègent pas. Les analyses fonctionnelles des changements c.1237G>A (p.V413M) ; c.1787C>T (p.T596M) et c.6359G>A (p.R2120H) dans le gène NOTCH1 ont été effectuées jusqu’à la préparation par mutagenèse in vitro des plasmides à exprimer. Ces expériences doivent être poursuivies par l’expression cellulaire pour confirmer ou infirmer leur implication dans la formation des malformations capillaires familiales.