Tassenoey, Emy
[UCL]
Vertommen, Didier
[UCL]
Lors de ce mémoire nous nous sommes intéressés à la CoAlation, une nouvelle modification post-traductionnelle impliquant la formation d’une liaison disulfure entre une cystéine et le groupement thiol d’un Coenzyme A. Cette modification post-traductionnelle permettrait, selon l’hypothèse actuelle, de protéger les cystéines lors d’une augmentation du niveau oxydatif au sein des cellules. Ce faisant, elle préviendrait l’oxydation irréversible de ces cystéines et éviterait la perte de fonction d’enzymes importantes à la survie cellulaire. En plus de les protéger, le CoA pourrait, de par sa structure similaire aux motifs-adénines, se replier dans les domaines Rossmann-analogues liant ces motifs et moduler ainsi l’activité d’enzymes. La CoAlation étant peu abondante, son enrichissement est nécessaire pour permettre l’analyse en Spectrométrie de masse des peptides la possédant. Étant donné que le CoA présente un groupement phosphoryle et une liaison diphosphodiester, nous avons fait l’hypothèse qu’il pourrait être enrichi par des méthodes permettant la capture de peptides phosphorylés. L’une de ces méthodes consiste à utiliser du TiO2, lequel forme un bidentate avec les groupements phosphoryles, permettant à ceux-ci de s’y adsorber. Ces peptides phosphorylés seront les contaminants majeurs de notre méthode d’enrichissement de peptides CoAlatés. L’utilisation de cette méthode devrait permettre d’identifier des peptides CoAlatés auxquels on n’aurait pas eu accès autrement. Pour étudier cette méthode d’enrichissement nous avons utilisé des solutions de CoA, 3’-DéphosphoCoA et Adénosine de concentration connue. Le DPCoA, du fait qu’il est identique au CoA à l’exception de son groupement phosphoryle manquant, permet d’étudier la capacité de la liaison diphosphodiester à former un bidentate avec le TiO2. L’Adénosine, quant à elle, ne possède aucun phospho-groupe et sert de contrôle négatif. Chacun de ces composés a été enrichi sur TiO2 afin d’en évaluer l’affinité. Le CoA a montré une bonne adsorption au TiO2, tandis que le DPCoA a montré une moindre adsorption. L’Adénosine, comme attendu, ne s’est pas adsorbée. Pour éliminer les groupements phosphoryles des lysats cellulaires nous utiliserons des phosphatases ; nous avons dès lors testé celles-ci sur nos différents composés. L’utilisation de phosphatase alcaline a diminué l’adsorption du CoA et du DPCoA, tandis que la phosphatase lambda n’a pas diminué leur adsorptivité. Cette dernière semble donc spécifique des groupements phosphoryles des peptides, sans impact sur le CoA. Des lysats de HEK293 exprimant de manière stable la PanK1beta ont été digérés, déphosphorylés en utilisant la phosphatase lambda et enrichis sur TiO2. L’analyse MS a permis d’identifier 7 protéines. Parmi celles-ci nous avons porté un intérêt particulier à la Malate Déhydrogénase et à la Hsp60. Nous avons effectué des analyses par Molecular Docking afin d’observer si le CoA était capable de favorablement se replier dans la poche catalytique de ces protéines. Après amélioration du protocole de déphosphorylation et de la méthode d’analyse MS, nous avons pu identifier 24 protéines. En conclusion, nous avons montré que le TiO2 permettait l’enrichissement de groupements CoA et que l’utilisation de phosphatases permettait d’en améliorer le rendement. Nous proposons plusieurs pistes permettant d’améliorer cette méthode d’enrichissement et évaluons ses avantages face à l’unique enrichissement existant jusqu’alors.
Bibliographic reference |
Tassenoey, Emy. Étude et enrichissement d’une modification post-traductionnelle : La CoAlation. Faculté de pharmacie et sciences biomédicales, Université catholique de Louvain, 2021. Prom. : Vertommen, Didier. |
Permanent URL |
http://hdl.handle.net/2078.1/thesis:33277 |