Caractérisation de variants d’un gène candidat en tant que mutations possibles associées au lymphœdème primaire

Les lymphœdème primaires (PLE) sont des pathologies chroniques d’origine génétique, dues à des dysfonctionnements du système lymphatique provoquant des accumulations de lymphe dans les tissus. À l’heure actuelle, 31 gènes ou loci ainsi que 18 demandant confirmation ont été identifiés comme responsables de PLE, mais ils n’expliquent que 30% des cas environ. Bien que de nombreuses études sur ces gènes aient permis de mieux comprendre les processus moléculaires à l’origine de ces pathologies, ce qui permettra d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles, il est clair que beaucoup d’aspects dans la pathogenèse des PLE nous échappent. Un gène codant pour un récepteur tyrosine kinase (RTK), exprimé notamment par les cellules endothéliales lymphatiques, est un candidat intéressant, qui pourrait être impliqué dans la survenue des PLE. En effet, c’est un partenaire central d’une voie impliquée dans la formation, la maturation, le maintien et le remodelage des vaisseaux sanguins et lymphatiques, ainsi que de leurs valves. Le laboratoire d’accueil (GEHU) a également récemment montré l’implication de mutations du ligand de ce RTK dans le lymphœdème primaire. Aujourd’hui, dans les exomes d’une cohorte de 742 patients atteints de PLE, 23 variants dans le gène du RTK d’intérêt ont été identifiés comme possiblement délétères pour la fonction de la protéine. Le but de ce travail est de caractériser ces variants afin de déterminer lesquels sont effectivement des mutations impliquées dans la pathogenèse de ce sous-groupe de PLE. Pour cela, des études de co-ségrégation familiale ont été réalisées afin de vérifier la transmission ou non des variants avec la maladie. Pour certains variants suspectés d’altérer l’épissage, une exploration de l’ARNm de cellules sanguines de ces patients a été réalisée. De plus, des études fonctionnelles utilisant plusieurs vecteurs permettant l’expression des variants du RTK dans des cellules HEK293T ont été réalisées afin d’étudier d’une part leur niveau d’expression relatif par western blot, et d’autre part leur localisation correcte à la membrane cytoplasmique à l’aide du FACS. Afin de caractériser ces variants dans des cellules plus représentatives des conditions (patho)physiologiques, nous avons également entamé la préparation de vecteurs lentiviraux permettant de surexprimer le RTK dans des cellules endothéliales lymphatiques primaires et obtenu quelques résultats préliminaires. De ces études, il ressort que certains variants sont effectivement délétères, à cause de problèmes d’épissage, d’expression, de localisation et/ou de phosphorylation. Primary lymphedemas (PLE) are pathologies of genetic origin, due to dysfunctions of the lymphatic system causing accumulations of lymph in the tissues. To date, 31 genes or loci and 18 requiring confirmation have been identified as causes of PLE, but they explain only about 30% of cases. Although many studies on these genes lead to a better understanding of the molecular processes causing PLE, which will allow to identify potential therapeutic targets, it is clear that we are still oblivious to many aspects in the pathogenesis of PLEs. A gene coding for a tyrosine kinase receptor (TKR) expressed by lymphatic endothelial cells among others, is a really interesting candidate, which could be involved in the onset of PLE. Indeed, it is a central partner of a metabolic pathway, involved in the formation, maturation, maintenance and remodelling of blood and lymphatic vessels, as well as their valves. The host laboratory (GEHU) has also recently shown the implication of mutations in the ligand of this TKR in primary lymphedema. In the exomes of a cohort of 742 patients presenting with PLE, 23 variants in the gene of the TKR of interest have been identified as possibly harmful to the function of the protein. The aim of this work is to characterize these variants to confirm them as mutations involved in the pathogenesis of this subgroup of PLE. First, familial co-segregation studies were carried out to check whether variants are inherited along with the disease phenotype or not. For some variants suspected to impair splicing, mRNA studies have been performed from patients’ blood samples. Moreover, functional studies were performed using vectors allowing the expression of variants of the TKR in HEK293T cells in order to examine on the one hand their relative level of expression by western blots, and on the other hand their correct localisation at the cytoplasmic membrane by FACS. To characterise these variants in cells closer to (patho)physiological conditions, we have also started to produce lentiviral vectors allowing us to overexpress the TKR in primary lymphatic endothelial cells and obtained a few preliminary results. From these studies, it appears that some variants are indeed deleterious, because of splicing, expression, localisation and/or phosphorylation issues.