Zusammenfassung
Microstructured interfaces such as micropillars made of polydimethyl-siloxane (PDMS) provide a novel approach both as topologically defined, force sensing substrates in cell culture as well as scaffolds for biomimetic protein assays. This work is divided into two parts. In the first part, PDMS micropillar arrays functionalized with fibronectin, are applied as a biomechanical microenvironment for immortalized human gingival keratinocytes (IHGKs) and gingival connective-tissue fibroblasts (GCTFs). IHGKs and GCTFs show successful adhesion and growth on the pillar heads and exert forces up to about 110 nN in the case of IHGKs and about 174 nN for GCTFs. Varying the interpillar distances affects the early keratinocyte differentiation and morphology. At decreasing inter-pillar distances the IHGKs show an increased keratin 1 (K1) extension in the cytoplasm, increased mRNA transcription of keratin 1 and a shape change from a more linear to a more round form. A novel GCTF-IHGK co-culture system is developed as a model of the epithelial tissue, to study explicitly the role of the GCTFs in the morphogenesis of the derived epithelial equivalents. The epithelial equivalents, cultured for 7 and 14 days on GCTF-populated pillar arrays, are found more similar to the in vivo phenotype than the GCTF-free cultures. These findings are confirmed by following the mRNA transcription levels for keratin 1. A novel, transparent microfluidic platform, based on PDMS pillars is developed in the second part of this work. It is designed to investigate actin cortex models and to provide control over the physicochemical environment, allowing simultaneous high resolution fluorescence microscopy. The formation of crosslinking networks is observed using various crosslinkers, such as filamin, myosin II, alpha-actinin and magnesium ions. Dependent of the geometric configuration of the actin filaments anchored to the pillar tops, so-called zipping crosslinks are observed. The zipping velocity is both influenced by the flow speed, as well as the number and the configuration of the filaments involved in the process. It is found to range between 2 - 15 µm/s. To further quantify the crosslinking process, the flow-cell is combined with an optical tweezers system. The unzipping forces are measured for the crosslinkers alpha-actinin and magnesium ions. Forces of about 17 - 20 pN are derived for magnesium ions and about 30-45 pN for alpha-actinin.
Mikrostrukturierte Oberflächen wie Mikrosäulen aus Polydimethyl-siloxan (PDMS) schaffen einerseits einen neuartigen Ansatz zur Kultivierung von Zellen auf topologisch definierten Oberflächen auf denen man Kräfte messen kann. Andererseits dienen sie auch als Gerüst für biomimetische Untersuchungen von Proteinen. Im ersten Teil werden Matrizen aus PDMS-Mikrosäulen, die mit Fibronektin funktionalisiert sind, als biomechanische Mikroumgebung für immortalisierte humane Gingiva- Keratinozyten (IHGKs) und Gingiva-Fibroblasten aus dem Bindegewebe (GCTFs) verwendet. IHGKs und GCTFs adhärieren und wachsen auf den Pillarköpfen. Die IHGKs üben Kräfte von bis zu 110 nN und die GCTFs von bis zu 174 nN auf die Pillarköpfe aus. Eine Veränderung der Pillarabstände beeinflusst die frühe Differentiation der Keratinozyten. Bei kleiner werdenden Pillarabständen weisen die IHGKs eine zunehmende Ausbreitung von Keratin 1 (K1) im Zytoplasma, eine zunehmende mRNA Transkription von Keratin 1 und eine Veränderung ihres Aussehens von einer mehr linearen Form zu einer mehr runden Form auf. Ein neuartiges Kokultursystem aus GCTFs und IHGKs wird entwickelt, um explizit die Rolle von GCTFs in der Morphogenese von den so erhaltenen Epitheläquivalenten zu untersuchen. Für Epitheläquivalente, die für 7 und 14 Tage auf Pillarfeldern kultiviert werden, auf denen sich GCTFs befinden, wird ein Phänotyp gefunden, der ähnlicher zu dem in vivo Phänotyp ist, als der, der auf GCTF-freien Kulturen gefunden wird. Diese Beobachtungen werden durch den mRNA Transkriptionsgrad für Keratin 1 bestätigt. Eine neuartige, transparente, auf PDMS-Säulen beruhende Mikrofluidikplattform wurde im zweiten Teil der Arbeit entwickelt. Diese wird hergestellt, um Modelle des Aktinkortex zu untersuchen. Sie erlaubt die Kontrolle über die physikalische und chemische Umgebung und ermöglicht Beobachtungen mittels hoch auflösender Fluoreszenzmikroskopie. Es wird die Bildung von mit Filamin, Myosin II, alpha-Aktinin und Magnesiumionen vernetzten Netzwerken beobachtet. Abhängig von der geometrischen Anordnung der auf den Pillarköpfen verankerten Aktinfilamenten lässt sich eine reißverschlussartige Vernetzungen beobachten. Die Vernetzungsgeschwindigkeit dieses so genannten Reißverschlusses wird sowohl durch die Flussgeschwindigkeit als auch durch die Anzahl und Anordnung der in diesem Prozess involvierten Filamente beeinflusst. Hierbei zeigt sich eine Geschwindigkeit zwischen 2-15 µm/s. Um den Vernetzungsprozess weiter zu quantifizieren, wird die Flusszelle mit einer optischen Pinzette kombiniert. Die Entnetzungskräfte werden für die Vernetzungsmediatoren alpha-Aktinin und Magnesiumionen gemessen. Für Magnesiumionen wird eine Kraft von 17-20 pN und für alpha-Aktinin von 30-45 pN erhalten.
