Bioingeniería de sensores biológicos. Aplicaciones en salud y biología sintética
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2021
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Resumen
Los receptores de membrana traducen estímulos ambientales extracelulares en
señales químicas intracelulares. Fallas en la señalización, provocadas por respuestas
pobres o exacerbadas, pueden poner en riesgo la vida de la célula u organismo. Dado que
la mayoría de las enfermedades presentan alguna disfunción en rutas metabólicas
mediadas por receptores transmembrana, hay un gran entusiasmo e interés en
identificar nuevos blancos de medicamentos, basándose en el conocimiento de los
mecanismos involucrados en la transducción de señales de receptores claves, que en su
mayoría son proteínas de membrana con actividad quinasa.
Los abordajes para estudiar receptores de membrana se han focalizado en el
dominio extracelular o en el dominio intracelular. A pesar de que el péptido inmerso en
la membrana lipídica constituye un paso obligado en la señalización, poco se sabe de su
mecanismo biofísico-molecular. En este trabajo de tesis, estudiaremos el rol del
Segmento Transmembrana (STM) en la transducción de señales de dos quinasas: DesK e
Ire1.
DesK es la quinasa encargada de mantener la homeostasis de Bacillus subtilis frente
a cambios en la fluidez de su membrana, como por ejemplo debido a descensos en la
temperatura. Esta posee cinco STM y un dominio catalítico citoplasmático (DesKC). Su
regulación fisiológica muestra que a menor temperatura presenta mayor actividad. Por
el contrario, una variante de DesK que carece de la región transmembrana activa la ruta
metabólica independientemente de la temperatura, con mayor actividad a 37°C que a
25°C, mostrando una regulación invertida respecto a DesK.
Para dilucidar cómo la región transmembrana de DesK controla al dominio catalítico,
trabajamos con una variante trunca que contiene el quinto segmento transmembrana
fusionado a DesKC (TM5-DesKC), la cual es inactiva a cualquier temperatura, y le
introdujimos residuos que pueden generar enlaces de tipo puente hidrógeno
interhelicoidales en una cara de la hélice que ya contiene tres residuos de serina
(aminoácido formador de un puente hidrógeno interhelicoidal). Con esta estrategia,
evidenciamos que el fortalecimiento de esta cara del STM activa al sistema a bajas
temperaturas. Además, al introducir estos residuos en la cara opuesta, totalmente hidrofóbica, la actividad y regulación del sensor se modulan: variantes con residuos
formadores de puente hidrógeno interhelicoidales en la cara opuesta a la cremallera de
serinas presentan mayor actividad a mayor temperatura.
Debido a que la construcción TM5-DesKC no es funcional sin el agregado extra de
residuos formadores de puente hidrógeno interhelicoidales, deducimos que la
interacción con los otros STM de DesK es necesaria para su actividad y adecuada
regulación fisiológica. Para entender cómo funciona DesK con sus cinco STM, diseñamos
un sistema de coexpresión que permite estudiar las interacciones in vivo entre hélices de
DesK. Este sistema nos permitió demostrar cómo las interacciones interhelicoidales
transmembrana contribuyen a la transmisión de la señal.
Finalmente, nos preguntamos si los puentes hidrógeno estarían involucrados en la
regulación de sensores de membrana en otros organismos. Para validar el principio
fisicoquímico hallado en DesK, analizamos el caso de Ire1, una quinasa con relevancia
clínica. Ire1 contiene un único STM y se ubica en la membrana del retículo endoplásmico
de todas las células eucariotas. A través de una serie de mutaciones en el STM de Ire1 y
medidas de actividad, mostramos que los aminoácidos formadores de puente hidrógeno
interhelicoidales son críticos para la actividad de la proteína.
De esta forma, proponemos que la cremallera de este tipo de residuos en distintos
STM permite modular la actividad enzimática: diferencias en la posición de los puentes
hidrógeno conlleva a diferentes conformaciones de los dominios citoplasmáticos
catalíticos.
Descripción
Palabras clave
Traducción de señales, Proteína quinasa, Proteína transmembrana