PROGRESSI NELLA TECNOLOGIA DEL VETTORE POXVIRALE MVA: 1. PRODUZIONE DI RICOMBINANTI ESPRIMENTI DUE TRANSGENI 2. TRANSATTIVAZIONE DI GENI CELLULARI

Modified Vaccinia Ankara virus (MVA) is an attenuated, Vaccinia-Virus-derived Poxvirus that is currently vastly used as a vector vaccine. Despite its replication-deficiency in mammalian cells, MVA delivers high-level transgene (TG) expression and this property accounts for its ability to induce a strong immunity response in the host. Methods used in the construction of recombinant MVA viruses (rMVA) rely on the homologous recombination that occurs between the viral genome and a donor plasmid, driven by homology regions contained in the latter. Recombinant clones are subsequently identified and efficiently selected by means of specific marker genes introduced within the recombination cassette (e.g. antibiotic resistance or fluorescent proteins). Thanks to an ever increasing interest in MVA manipulation and engineering, quite a few improvements have been carried out in the past twenty years. Nevertheless, the search for new strategies and applications is still ongoing: the following work fits into this research field and consists of two different approaches that, taken together, aim for the development of new strategies to enhance and refine MVA into a even more flexible, strong and versatile tool, both in the fundamental and clinical research. Similarly to traditional vaccines which can include several antigens, rMVAs can also carry two or more TG, yielding a multiple rMVA (mrMVA). Several mrMVA recombination techniques have already been described, but most of them are unable to achieve a completely independent gene transcription and translation. For example, equimolar expression is mandatory if the TGs associate in a multimeric protein, avoiding subunit precipitation or faulty interactions. In the first part of this work, a new mrMVA construction strategy is described: exploiting Red-to-Green gene swapping technique (Di Lullo et al., 2010) to introduce TGs in different regions of the viral genome (namely ΔIII and ΔVI), gene expression independence is obtained. The first mrMVA herein described, MVA HLAC(ΔIII)ENV(ΔVI), was generated using MVA ENV(ΔVI), thus introducing HLAC in ΔIII region. On the contrary, the second virus, MVA HA(ΔIII)NP(ΔVI), followed a reverse strategy, undergoing NP recombination into ΔVI region of MVA HA(ΔIII). This required two new transfer plasmid to be constructed, containing the homology flanking regions to ΔVI, p675 and p604, respectively the donor of the red protein HcRED and the transfer plasmid green harbouring the MCS and the green fluorescent protein EGFP. Both double recombinant viruses were assayed for TG expression: no differences were observed when comparing the mrMVAs to the respective single-recombinant rMVAs, confirming that this strategy is suitable for inserting TGs into different regions of mrMVA. Currently, the primary use of rMVAs falls within the direct vaccination against the carried TGs, nonetheless the real potential of MVA-based vectors remains to be fully understood and exploited. An alternative application of rMVA-based vector is described in the second part of this work, in which a transactivator-harbouring rMVA is used to promote the expression of endogenous proteins. MVA fCIITA(ΔIII), carrying a flag-M2-tagged version of human CIITA gene, was constructed using Red-to-Green gene swapping and subsequently assayed for MHC-Class-II transactivation capability through western blot, flowcitometry and immunofluorescence assays. The results showed that viral infection did not interfere with CIITA-induced Class-II overexpression and localization both in human and murine cells. Several studies pinpointed the CIITA-driven Class-II overexpression on the surface of some cancer cells as a potential immunotherapeutic approach: disguised as APCs, these cells could indeed initiate an antitumor response. Since CIITA delivery methods tested so far are time-demanding and inefficient, the use of MVA fCIITA(ΔIII) has been taken into account. In order to assess the T-helper-induction capability of MVA fCIITA(ΔIII) compared to a mock virus, two groups of C57BL/6 mice were i.m. immunized following a prime/boost protocol. At the end of the immunization, sera were taken and underwent ELISA to evaluate the anti-MVA antibody titer, but no significant differences were observed between the experimental groups. Accordingly, the distribution of T CD4+ subsets in MVA-fCIITA(ΔIII)-vaccinated mice did not greatly differ from the mock-vaccinated, suggesting that MVA fCIITA(ΔIII) was not able to boost the anti-vector humoral response, which was possibly already saturated. Therefore, additional studies are being carried out to evaluate MVA fCIITA(ΔIII) capability to stimulate the cell-mediated immunity in other experimental models. Should the immunostimulatory or immunomodulatory role of MVA fCIITA(ΔIII) be assessed and clarified, a new powerful immunotherapeutic tool might become available.

Il virus Modified Vaccinia Ankara (MVA) è un ceppo fortemente attenuato di Vaccinia Virus ed è da tempo utilizzato in qualità di vettore vaccinale nell’uomo. La totale incapacità di replicare in cellule di mammifero unita agli alti livelli di espressione dei transgeni (TG) veicolati costituiscono i punti di forza di MVA e ne fanno un vettore estremamente sicuro e potente, in grado di indurre una forte risposta immunitaria nei soggetti vaccinati. Uno dei metodi più impiegati per la costruzione di virus MVA ricombinanti (rMVA) sfrutta la ricombinazione omologa tra specifiche regioni del genoma virale e un plasmide donatore, contenente due sequenze di omologia che indirizzano la ricombinazione. La selezione dei cloni ricombinanti viene generalmente effettuata introducendo marker che determinano alterazioni nel fenotipo delle cellule infettate (ad esempio, resistenza ad antibiotici o proteine fluorescenti) e grazie ai quali è possibile aumentare notevolmente l’efficienza. L’interesse suscitato in ambito scientifico e medico da parte di MVA ha fornito una notevole spinta all’ideazione di nuove strategie volte alla sua manipolazione ed ingegnerizzazione, come dimostrato dai notevoli progressi compiuti nell’ultimo ventennio. Il lavoro svolto in questa tesi, suddivisa in due parti, si inserisce in questo ambito e ha come scopo lo sviluppo di nuovi metodi nel tentativo di rendere MVA un vettore sempre più duttile, potente e versatile nell’ambito della ricerca sia di base sia clinica. Così come i vaccini più tradizionali possono essere costituiti da diversi antigeni, anche i virus rMVA possono essere ingegnerizzati per esprimere due o più TG (mrMVA). Strategie per la generazione di mrMVA sono già descritte in letteratura, ma non si sono dimostrate completamente soddisfacenti, soprattutto per quanto riguarda l’indipendenza trascrizionale e traduzionale dei TG. Questo è un prerequisito molto importante qualora i TG, ad esempio, dovessero assemblarsi secondo precisi rapporti stechiometrici a formare una proteina multimerica. Nella prima parte di questo lavoro di tesi viene descritta una nuova strategia di costruzione di mrMVA basata sul Red-to-Green gene swapping (Di Lullo et al., 2010) che permette l’inserimento dei TG in punti diversi del genoma, in particolare all’interno delle regioni ΔIII e ΔVI, assicurandone pertanto la totale indipendenza. Il primo virus mrMVA presentato, MVA HLAC(ΔIII)ENV(ΔVI), è stato costruito a partire da un rMVA già contenente il gene ENV nella regione ΔVI e inserendo HLAC nella regione ΔIII applicando direttamente il metodo del Red-to-Green gene swapping. Il secondo virus, MVA HA(ΔIII)NP(ΔVI), è stato invece costruito in maniera del tutto speculare, partendo da un rMVA contenente HA nella regione ΔIII e inserendo NP nella regione ΔVI. La strategia di ingegnerizzazione impiegata per quest’ultimo ha richiesto la costruzione di due nuovi plasmidi di trasferimento, contenenti le sequenze di omologia per la regione ΔVI, rispettivamente p675 (plasmide donatore della proteina rossa HcRED) e p604 (plasmide di trasferimento contenente un MCS e la proteina verde EGFP). Entrambi i virus sono stati poi saggiati per valutare l’espressione dei TG contenuti e confrontati con i virus rMVA singoli: non essendo state individuate differenze, è stato concluso che la strategia presentata è adatta alla generazione di mrMVA recanti TG in regioni diverse. Nonostante l’importanza che MVA ricopre nel panorama scientifico e medico, la piena potenzialità di questo virus non è ancora stata raggiunta: il suo impiego, infatti, è stato finora limitato a quello di carrier di TG contro i quali indurre una risposta immunitaria, benché esistano altre strategie che non coinvolgano la diretta presentazione dei TG al sistema immunitario. Una di queste è la possibilità di promuovere l’espressione di geni cellulari sfruttando fattori di trascrizione, induttori o transattivatori opportunamente inseriti all’interno del vettore MVA. Per approfondire questo campo d’indagine, è stato selezionato CIITA, gene fisiologicamente espresso nelle cellule presentanti l’antigene (APC) e responsabile dell’espressione di MHC Classe-II. Nella seconda parte di questo lavoro è stato pertanto costruito, attraverso la tecnica del Red-to-Green gene swapping, il virus MVA fCIITA(ΔIII), contenente il gene CIITA fuso al tag M2 all’interno della regione ΔIII. Come confermato a mezzo di western blot, saggi citometrici e immunofluorescenza, MVA fCIITA(ΔIII) si è rivelato in grado di indurre un fenotipo Classe-II+ in cellule umane e murine, dimostrando che l’infezione virale non interferisce con l’attività transattivatoria di CIITA. Considerato che l’overespressione della Classe-II sulle cellule tumorali ha prodotto interessanti, benché eterogenei, risultati nel campo dell’immunoterapia e che i metodi di gene delivery finora impiegati risultano poco efficienti o dispendiosi in termini di tempo, è stata presa in considerazione la possibilità di veicolare CIITA all’interno di cellule tumorali sfruttando il virus costruito. In via preliminare, è stata saggiata in vivo la capacità di MVA fCIITA(ΔIII) di stimolare il ramo T-helper mediante due immunizzazioni intramuscolari consecutive. Al termine dell’immunizzazione sono state valutate sia la risposta anti-vettore attraverso un saggio ELISA sia la distribuzione delle popolazioni linfocitarie CD4+ mediante citometria su cellule estratte da linfonodi. I risultati, tuttavia, non hanno messo in mostra differenze significative rispetto al controllo: l’assenza dell’effetto biologico, ossia l’aumento di anticorpi anti-vettore, è risultata infatti in linea con la mancata over-stimolazione dei linfociti T-helper. Data la possibilità che la risposta anti-vettore fosse già completamente satura, impedendo di fatto l’ulteriore stimolazione del ramo umorale, sono in corso ulteriori saggi in vivo per la valutazione funzionale del virus costruito inerente ad una possibile stimolazione del ramo cellulare dell’immunità acquisita. Qualora la capacità immunostimolatoria e/o immunomodulante di MVA fCIITA(ΔIII), eventualmente in associazione con adiuvanti, venisse confermata, si avrà a disposizione un ottimo strumento per valutare in maniera rapida e sicura in quali tumori l’overespressione della Classe-II svolge un ruolo efficace nell’induzione di una risposta immunitaria antitumorale.