Caracterização epidemiológica da criptosporidiose em Portugal, por estudo molecular de isolados de Cryptosporidium spp. de humanos e de animais

Abstract

Cryptosporidium spp. é um protozoário ubíquo causador de patologia gastrintestinal em humanos e animais. A infecção ocorre por ingestão de oocistos, após contacto directo com pessoas – transmissão antroponótica – ou outros animais infectados – transmissão zoonótica – podendo, ainda, ocorrer, indirectamente, através da água ou de alimentos contaminados. A importância relativa dos diferentes modos de transmissão, não se encontra, ainda, esclarecida. A criptosporidiose humana está associada, sobretudo, à infecção por C. hominis e por C. parvum, embora se encontrem descritos, também, casos de infecção por C. felis, C. meleagridis, C. muris, C. canis, C. suis e Cryptosporidium genótipo cervo. Com o presente trabalho pretendeu-se determinar as espécies e genótipos de Cryptosporidium que, em Portugal, se encontram associadas, quer à infecção humana, quer à infecção em gado doméstico, animais de companhia e animais silváticos, a fim de identificar, não só os parasitas infectantes para o Homem, como, também, os seus possíveis reservatórios zoonóticos. Para além disso, foi, ainda, objectivo deste trabalho, contribuir para a compreensão do papel desempenhado pelas vias de transmissão zoonótica e antroponótica na epidemiologia da criptosporidiose humana no nosso País. Na população de infectados por VIH, com sintomatologia gastrintestinal, que estudámos, entre Junho de 2001 e Janeiro de 2005, foi encontrada a percentagem de infecção por Cryptosporidium spp. de 8,3% (18/217). Nos animais de companhia, a taxa de infecção obtida para gatos com dono e para cães com e sem dono foi de, respectivamente, 1,8% (2/109) e 0% (0/157). Nos animais silváticos de vida livre estudados, carnívoros e pequenos mamíferos, não foi encontrada infecção por Cryptosporidium spp.. Nos animais do Jardim Zoológico de Lisboa, apenas foram encontrados oocistos em duas amostras fecais de mamíferos, uma de um bisonte americano e, outra, de um gnu de cauda branca, correspondendo a uma percentagem de amostras positivas de 0,9% (2/217); também foram observados oocistos numa amostra fecal de uma tartaruga estrela indiana que havia chegado recentemente ao Jardim Zoológico. A caracterização molecular de isolados humanos de Cryptosporidium spp., detectados entre 1994 e 2005, permitiu identificar, ao nível da espécie, 51 parasitas: 52,9% (27/51) pertenciam à espécie C. parvum, 31,4% (16/51) a C. hominis, 9,8% (5/51) a C. felis e 5,9% (3/51) a C. meleagridis. No que se refere aos criptosporídeos de hospedeiros não humanos – gado doméstico e ruminantes silváticos (gamos da Tapada Nacional de Mafra e Bovídeos do Jardim Zoológico de Lisboa), estudados retrospectivamente, e gatos e animais do Jardim Zoológico, estudados prospectivamente –, nos casos em que a amplificação do DNA foi bem sucedida, os resultados da sua caracterização molecular mostraram que: i) 94% (80/85) dos isolados bovinos e todos os isolados de ovinos (n = 2), de gamos da Tapada de Mafra (n = 4) e de Bovídeos do Jardim Zoológico (n = 11) pertenciam à espécie C. parvum; ii) 2,4% (2/85) dos isolados bovinos pertenciam à espécie C. bovis; iii) 2,4% (2/85) dos isolados bovinos pertenciam à espécie C. andersoni; iv) 1,2% (1/85) dos isolados bovinos pertenciam ao genótipo semelhante ao do gamo; v) os isolados detectados nos dois gatos pertenciam à espécie C. felis; vi) os parasitas encontrados nas fezes do bisonte americano, do gnu de cauda branca e da tartaruga estrela indiana pertenciam, respectivamente, ao genótipo rato, a um genótipo novo e ao genótipo tartaruga. Entre as espécies e genótipos identificados nos isolados animais, duas – C. parvum e C. felis – foram, também, encontradas em infecções humanas, facto que nos leva a considerar os seus respectivos hospedeiros – gado doméstico, ruminantes silváticos e gatos – como possíveis reservatórios zoonóticos da infecção humana. A determinação da diversidade intra-específica de C. hominis e de C. parvum foi realizada por caracterização molecular de um locus de microssatélites – ML2 – e do gene GP60. A análise de fragmentos por metodologia fluorescente do STR ML2, revelou a ausência de variabilidade genética em C. hominis e permitiu caracterizar, somente, 47% (8/17) dos isolados de C. parvum humanos estudados; a presença de múltiplos picos nos electroforetogramas dos restantes parasitas de origem humana e nos de todos os outros animais impediu a identificação dos seus alelos. Os dois alelos identificados nos oito isolados de C. parvum humanos – ML2-176 e ML2-191 – não foram encontrados em nenhum dos parasitas de gado doméstico ou de ruminantes silváticos. Em virtude da impossibilidade de identificar o alelo de todos os parasitas da espécie C. parvum em estudo, a caracterização do locus ML2 mostrou ser de pouca utilidade para o nosso trabalho. A caracterização do gene GP60, permitiu identificar nove famílias de subtipos, quatro em C. parvum e cinco em C. hominis. Entre os parasitas da espécie C. parvum, os de origem humana apresentaram maior variabilidade de subtipos do que os de gado bovino e de ruminantes silváticos. A maioria dos isolados de gado bovino (61/72), um de gado ovino, um de gamos da Tapada de Mafra e todos os dos Bovídeos do Jardim Zoológico (n = 9) apresentaram o mesmo subtipo – IIaA15G2R1 –, o qual foi, também, encontrado em nove isolados humanos. O segundo subtipo de C. parvum mais frequente em isolados bovinos – IIaA16G2R1 – não foi encontrado em isolados humanos. Os dois subtipos menos frequentes em gado bovino e ovino – IIdA17G1 e IIdA21G1 – foram, também, identificados em isolados humanos. Em alguns parasitas humanos de C. parvum foram, ainda, encontrados quatro subtipos, pertencentes a três famílias, não identificados nos isolados de gado doméstico ou de ruminantes silváticos – IIbA14, IIcA5G3, IIdA19G1 e IIdA22G1. O facto de, em Portugal, isolados de C. parvum com o mesmo subtipo terem sido encontrados em infecções, não só humanas, como, também, de gado doméstico e de ruminantes silváticos indica que a sua transmissão ao Homem pode ocorrer pela via zoonótica e, também, pela antroponótica. Ainda, a identificação, em isolados de C. parvum humanos, de famílias/subtipos não encontrados nos animais, coloca a hipótese destes parasitas serem transmitidos ao Homem, unicamente, pela via antroponótica. Em suma, os resultados obtidos no presente trabalho sugerem que, em Portugal, a transmissão de C. parvum ao Homem envolve dois grupos de parasitas, um constituído por aqueles que são transmitidos, quer pela via zoonótica, quer pela antroponótica e, outro, composto pelos que são veiculados, exclusivamente, pela via antroponótica.

Cryptosporidium species are protozoan parasites that emerged worldwide as a cause of diarrhoeal disease in humans and animals. Infection can be transmitted through person-toperson – anthroponotic transmission –, animal-to-person contact – zoonotic transmission – or by ingestion of contaminated water or food. The influence of each transmission route in the transmission dynamics of cryptosporidiosis is not yet fully understood. Although human infections are caused, mainly, by C. parvum and C. hominis, several other species have also been associated with human disease – C. felis, C. meleagridis, C. muris, C. canis, C. suis and Cryptosporidium cervine genotype. With this work we intended to identify the Cryptosporidium species and genotypes responsible for human infections in Portugal as well as those that parasitize cattle, pets and wild animals, in order to determine which ones are infectious for humans and also their possible zoonotic reservoirs. In addition, we also intended to establish the role of each transmission route in the epidemiology of cryptosporidiosis in Portugal. The rate of Cryptosporidium spp. infection in the HIV-infected patients with gastrointestinal symptoms, studied between June 2001 and January 2005, was 8,3% (18/217). In pets, 1,8% (2/109) of the privately owned cats and 0% (0/157) of the privately owned and shelter dogs were excreting Cryptosporidium spp. oocysts. In free-ranging wild animals, carnivores and small mammals, no oocysts were found in the faecal samples studied. In animals kept at the Lisbon Zoo, the rate of positive faecal samples among the mammals examined was 0,9% (2/217), corresponding to a black wildebeest and a prairie bison excreting oocysts in their faeces; Cryptosporidium spp. was also found in the faeces of an indian star tortoise newly arrived at the Zoo. Molecular characterization of human Cryptosporidium spp. isolates, detected between 1994 and 2005, was successfully accomplished for fifty-one parasites: 52,9% (27/51) were identified as C. parvum, 31,4% (16/51) as C. hominis, 9,8% (5/51) as C. felis and 5,9% (3/51) as C. meleagridis. Concerning the parasites from non-human hosts – cattle and wild ruminants (fallow deers from Tapada Nacional de Mafra and Bovids from the Lisbon Zoo), studied retrospectively, and cats and Zoo animals, studied prospectively – in those with positive DNA amplification, the results of its molecular characterization showed that: i) 94% (80/85) of the bovine isolates and all the isolates from sheep (n = 2), fallow deers from Tapada de Mafra (n = 4) and Bovids from the Zoo (n = 11) were identified as C. parvum; ii) 2,4% (2/85) of the bovine isolates were identified as C. bovis; iii) 2,4% (2/85) of the bovine isolates were identified as C. andersoni; iv) 1,2% (1/85) of the bovine isolates were identified as Cryptosporidium deer-like genotype; v) the isolates from cats were identified as C. felis; vi) the isolates from the black wildebeest, the prairie bison and the indian star tortoise were identified as the mouse genotype, a novel unidentified genotype and the tortoise genotype, respectively. Two of the species found in animal infections – C. parvum and C. felis – were also found to cause human disease, suggesting that these species’ hosts – cattle, wild ruminants and cats – may act as zoonotic reservoirs for human cryptosporidiosis. The evaluation of the intra-specific heterogeneity within C. hominis and C. parvum was achieved by molecular characterization of a microsatellite locus – ML2 – and the GP60 gene. The fragment analysis of the ML2 STR showed no genetic variation within C. hominis and enabled allele identification only in 47% (8/17) of the studied human C. parvum isolates; the presence of stutter bands in the electrophoretograms from the remaining human parasites and in those from all the animal isolates impaired the identification of their alleles. The two alleles found in the eight human C. parvum parasites – ML2-176 and ML2-191 – were not found in any C. parvum isolate from cattle or wild ruminants. As the genetic characterisation of all C. parvum parasites was not achieved, the ML2 approach had little usefulness for our study. The PCR and sequencing of the GP60 gene enabled the identification of nine subtype families, four in C. parvum and five in C. hominis. We found higher subtype variability among human C. parvum isolates than in those from cattle and wild ruminants. Most of the C. parvum isolates from cattle (61/72), one isolate from sheep, one isolate from a fallow deer and all the isolates from the Lisbon Zoo Bovids (n = 9) presented the same subtype – IIaA15G2R1 –, the one that was also found in nine human isolates. The second most frequent C. parvum subtype found in cattle isolates – IIaA16G2R1 – was not identified in human parasites. The two less frequent subtypes found in cattle and sheep – IIdA17G1 and IIdA21G1 – were also present in isolates from humans. In some human C. parvum parasites, we found four subtypes, belonging to three subtype families, which were not identified in isolates from cattle or wild ruminants – IIbA14, IIcA5G3, IIdA19G1 and IIdA22G1. Finding C. parvum isolates with the same subtype in human, cattle and wild ruminant infections indicates that these parasites may be transmitted to humans by zoonotic as well as by anthroponotic transmission. Also, the identification of human C. parvum isolates with families/subtypes that were not found in parasites from cattle or wild ruminants points out the hypothesis that these parasites may be transmitted to humans exclusively by anthroponotic transmission. So, the results of the present study suggest that, in Portugal, transmission of C. parvum to humans involves two groups of parasites, one containing those that can be transmitted by both zoonotic and anthroponotic cycles and another comprising the parasites that are transmitted exclusively by anthroponotic cycles.