Role of toll-like receptor 2 and 4 in host immune response against acinetobacter baumannii

Abstract

최근 수년에 걸쳐 Acinetobacter 속에 대한 과학적 혹은 대중적 관심이 급격하게 증가하고 있다. 톨유사 수용체 (toll-like receptors, TLRs)는 가장 많이 연구된 패턴인식 수용체 (pattern recognition receptors, PRRs)이며 TLR2와 TLR4는 병원성 세균의 인식에 매우 중요한 역할을 한다. TLR2는 세균의 지질단백을 인식하며 TLR4는 그람음성균의 주요 세포벽 구성물인 LPS의 인식수용체이다. 본 연구들에서는 TLR2 및 TLR4를 중심으로 A. baumannii에 대한 면역세포 및 숙주의 선천면역 기전을 연구하였다. 첫 번째 연구에서는 A. baumannii에 대항하는 면역세포의 선천면역반응에서 TLR4 및 TLR2의 역할을 조사하였다. 이를 위하여 야생형 혹은 TLR 결핍 마우스에서 골수유래 대식세포 및 수지상 세포를 분리한 후, A. baumannii를 감염시켰다. ELISA 분석시 A. baumannii에 의한 IL-6 및 TNF-α의 생산이 TLR4 결핍 대식세포에서 감소하는 것이 확인되었다. 그러나, TLR2의 결핍은 골수유래 대식세포에서 A. baumannii에 의한 사이토카인 생성에 영향을 미치지 않았다. 또한, TLR4는 골수유래 수지상 세포에서 A. baumannii에 의한 IL-6, TNF-α 및 IL-12의 생산에 필요하였다. Western blot 분석을 통하여 A. baumannii가 대식세포에서 TLR4 의존적인 경로로 NF-κB와 MAPK (p38, ERK 및 JNK)의 활성을 유도하는 것이 확인되었다. 야생형 골수유래 대식세포에서 A. baumannii에 반응하여 iNOS의 mRNA 발현 및 NO 생산이 유도되었으나 TLR4 결핍 세포에서는 대부분 소실되었다. TLR4가 결핍된 골수유래 대식세포에서 A. baumannii에 대한 탐식 능력은 야생형과 비교하여 차이가 없었으나 사멸 능력은 현저하게 감소하였다. 또한, A. baumannii에 의해 유도되는 골수유래 대식세포의 자연사는 TLR4와 무관한 기전으로 유도되는 것이 확인되었다. 두 번째 연구에서는 야생형, TLR2 및 TLR4 결핍 마우스에 비강 경로로 A. baumannii를 감염시키고 이에 대항하는 숙주방어 기전에서 TLR2 및 TLR4의 역할을 규명하였다. 세균감염 후, 체중, 폐의 세균수, 기관지 폐포액의 사이토카인과 키모카인 및 폐의 조직병리를 비교 관찰하였다. 시험기간 동안, TLR2 결핍 마우스의 체중소실은 야생형 마우스와 유사하게 나타났으나 TLR4 결핍 마우스에서는 유의적으로 적게 나타났다. 폐에서 산정된 세균 수는 TLR2 결핍 마우스에서는 감염 1일 후에, TLR4 결핍 마우스에서는 감염 1일, 3일 및 5일 후에 야생형 마우스보다 유의적으로 증가하였다. 야생형 마우스와 비교하였을 때, TLR2 결핍 마우스에서 폐의 IL-6와 CXCL2 생성이 감염 1일차에 유의적으로 증가하였다. TLR4 결핍 마우스에서는 사이토카인과 키모카인 농도가 1일차에 유의적으로 증가하였으며 이후에는 감소하였다 폐의 조직병리 관찰시, TLR2 결핍 마우스는 야생형에 비하여 주목할만한 차이를 보이지 않았으나 TLR4 결핍 마우스에서는 감염 5일차에 염증이 현저하게 감소하였다. 본 연구를 통하여 A. baumannii 감염에 대항하는 면역세포 및 숙주의 선천면역 반응에서 TLR4가 필수적이며 TLR2는 숙주방어의 초기단계에 영향을 미친다는 것이 증명되었다.

Interest in the genus Acinetobacter, from both the scientific and public community, has risen sharply over recent years. Toll–like receptors (TLRs) are the most studied pattern recognition receptors (PRRs) and TLR2 and TLR4 play important roles in the recognition of bacterial pathogen. TLR2 is a membrane sensor for bacterial lipoprotein and TLR4 has been identified as a sensor for LPS, a major cell wall component of Gram-negative bacteria. In these studies, we investigated in vitro and in vivo innate immune mechanism against Acinetobacter baumannii focusing on TLR2 and TLR4. In the first study, we studied the role of TLR2 and TLR4 on innate immune responses of immune cells against A. baumannii. Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) and bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) were isolated from wild type (WT), TLR2- and TLR4-deficient mice and infected with A. baumannii. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) were performed revealing that the production of interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) by A. baumannii was impaired in TLR4-deficient macrophages. In addition, TLR4 was required for the optimal production of IL-6, TNF-α, and IL-12 in BMDCs in response to A. baumannii. However, the absence of TLR2 did not affect A. baumannii-induced cytokines production in BMDMs. Western blot analysis showed that A. baumannii leads to the activation of nuclear factor-kappa B (NF-κB) and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) in macrophages via TLR4-dependent pathway. mRNA expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and nitric oxide (NO) production was elicited in WT BMDMs in response to A. baumannii, which was abolished in TLR4-deficienct cells. Although TLR4 deficiency did not affect phagocytic activity of macrophages against A. baumannii, bacterial killing ability was impaired in TLR4-deficient BMDMs. In addition, A. baumannii induced apoptosis in BMDMs via TLR4-independent pathway. In the second study, WT, TLR2- and TLR4-deficient mice were infected intranasally with A. baumannii to determine the role of TLR2 and TLR4 in host defense against A. baumannii infection. Body weight, pulmonary bacterial load, cytokine and chemokine levels in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and lung histopathology were examined after infection. Body weight loss of TLR2-deficient mice was comparable to WT mice but that of TLR4-deficient mice was significantly less than WT mice. Pulmonary bacterial loads of TLR2-deficient mice were only increased at 1 day and those of TLR4-deficient mice were higher than WT mice at 1, 3 and 5 days after infection. In TLR2-deficient mice, there was a significant increase in pulmonary IL-6 and chemokine (C-X-C motif) ligand 2 (CXCL2) at 1 day after infection. When compared with WT mice, cytokine and chemokine concentrations of TLR4-deficient mice were significantly increased at day 1 but decreased thereafter. The histopathological features of lung tissue were comparable between WT and TLR2-deficient mice but inflammation was marked alleviated in TLR4-deficient mice compared with WT mice at 5 days after infection. In conclusion, our studies demonstrated that TLR4 was essential for inducing innate immune response in immune cells and host against A. baumannii and TLR2 contributed to the host defense against A. baumannii at an early stage of infection.