Map-based Cloning of the Low Temperature Sensitive Gene sy-2 in Pepper (Capsicum chinense), and the Study of Cytoplasmic Male Sterility in Transgenic Chinese Cabbage (Brassica rapa) Overexpressing the Pepper Orf456 Gene

Abstract

온도는 작물의 생산성과 지리적 분포에 영향을 미치는 가장 중요한 환경적 요인 중 하나이다. 열대지역 및 아열대 지역에서 유래한 원예 작물들은 온도에 매우 민감하며, 특히 저온 장해를 입을 가능성이 매우 높다. 1989년 일본 연구진들에 의해 아프리카의 세이첼 섬에서 자생하며, 24°C 이하의 온도에서 기형을 보이는 고추 계통 sy-2 (C. chinense, Seychelles-2)를 발견되었다. 온도 민감성 유전자 sy-2는 이전 연구에서 토마토 염색체 1번에 위치한 Ch1_scaffold 00106 의 300 kb 지역에 매핑되었다. 본 연구에서는 sy-2 유전자를 밝히기 위하여 sy-2 유전자좌에 대한 미세유전자 지도 작성 및 염색체지도 기반 클로닝법을 활용하였다. 1장에서는 두 개의 F2 분리집단을 활용하여 sy-2 유전자좌에 대한 미세유전자 지도를 작성하였다. 토마토 스캐폴드(C01HBa0051C14)와 고추 스캐폴드(2607(377.77 kb), 3515(200.85 kb), 2510(318.608 kb) 간의 비교를 통하여 14개의 SNP 마커와 4개의 KASP 마커를 개발하였으며, 그 중 SNP5-5마커와 SNP3-8 마커 사이에 sy-2 유전자가 위치하였다. 이 지역은 고추 염색체 1번의 말단으로, 138.8 kb의 물리적 거리 이내에 27개의 유전자가 예측되었다. 2장에서는 예측한 유전자에 대한 RNA-seq, RT-PCR, qPCR 분석을 진행하였다. RNA-seq을 이용하여 저온 조건이 주어졌을 때 야생형과 sy-2 계통 간에 발현 차이를 보이는 유전자의 히트맵을 작성하였다. RNA-seq과 RT-PCR 결과를 통해 sy-2 계통에서 발현이 감소하는 ORF10과 ORF20을 최종 후보 유전자로 선발하였다. qPCR 분석으로 두 유전자의 발현을 확인하였으며, ORF10 유전자는 20oC에서 sy-2 계통에 비해 야생형 계통에서 8.2 배 높게 발현하였다. 염기서열 분석으로 sy-2 유전자 특이적인 변이 서열을 확인하였으며, 이는 ORF10 유전자의 C231G, N315D 및 ORF20 유전자의 S256K 아미노산 서열 변화를 유도하였다. 종합하면 ORF10 과 ORF20 유전자는 kelch type F-box 단백질을 암호화 하는 것으로 예상되며, 야생형과 sy-2 계통에서 발현양의 차이를 보였다. VIGS 실험을 진행하여 ORF10, ORF20 유전자의 발현을 각각 감소시킨 식물체에서는 sy-1 계통과 같이 신엽의 생장이 억제되는 현상을 관찰할 수 있었다. 두 유전자를 동시에 억제시킨 식물체에서는 3주 후 생장이 심하게 억제되었으며, 본엽이 하얗고 길게 자랐으며, 비대칭적이며 두껍게 자라 20oC에서 자라난 sy-2 계통과 유사한 외형을 보였다. 3장에서는 고추의 세포질적 웅성불임을 유도하는 유전자인 orf456의 기능을 알아보기 위하여 배추(Brassica rapa L.)에 형질전환하는 실험을 진행하였다. 전체 T1 형질전환체의 약 50%인 30개의 형질전환 배추에서 웅성불임을 보였다. 그럼에도 불구하고 orf456 유전자가 웅성불임을 유도하는 정확한 기작은 밝힐 수 없었다.

Temperature is one of the main environmental factors affecting the productivity and geographical distribution of crops. Many horticultural crops originating from the tropical or subtropical regions are temperature sensitive and susceptible to low temperature injury. The pepper cultivar sy-2 (C. chinense, Seychelles-2) native to the Seychelles in Africa was found by Japanese researchers in 1989, exhibits developmental abnormalities when grown under temperatures lower than 24°C. Previous studies have mapped the sy-2 gene to a 300 kb region of the Ch1_scaffold 00106 in tomato chromosome 1, but the sy-2 gene was not formally identified. To facilitate the identification of the sy-2 gene, fine mapping of the sy-2 locus and map-based cloning of the sy-2 gene were performed. In chapter I, a fine map of the sy-2 locus was developed using two F2 populations, and 14 SNP and four KASP markers derived from comparative analysis of genomic sequences between tomato scaffold (C01HBa0051C14) and pepper scaffold (2607 (377.77 kb), 3515 (200.85 kb), and 2510 (318.608 kb)). The sy-2 gene was delimitated between SNP5-5 and SNP3-8 at the distal region of pepper chromosome 1 spanning the target region of 138.8 kb. Gene annotation of the region showed 27 predicted genes. In chapter II, the predicted genes were analyzed using RNA-seq, RT-PCR and qPCR methods. RNA-seq analysis was carried out and a heat map was constructed to show differential expression of candidate genes between the wild-type and sy-2 plants under cold stress conditions. The RNA-seq and RT-PCR results showed that predicted gene ORF10 and ORF20 were apparently down-regulated in sy-2 plants. qPCR analysis was also performed to confirm ORF10 and ORF20 gene expression patterns. Expression levels of ORF10 were 8.2 times higher in wild-type plants than in sy-2 plants at 20°C. DNA sequencing identified several sy-2 specific SNPs that encode amino acid mutations C231G and N315D for ORF10 and S256K for ORF20. Overall, among the predicted sy-2 candidate genes, ORF10 and ORF20, which are predicted to encode kelch type F-box proteins, were observed to be differentially expressed in wild-type and sy-2 plants. Gene suppression experiments were carried out using VIGS. Following infection, plants with gene suppression of ORF10 and ORF20 showed moderate growth retardation of newly emerging leaves, with what appears to be similar growth characteristic to the sy-2 plant. Plants grown with co-suppression of both ORF10 and ORF20 displayed severe growth retardation after 3 weeks, with emerging true leaves exhibiting loss of pigmentation, as well as narrow, asymmetric and thicker growth, which is similarly to the leaf growth of the sy-2 plant grown at 20°C. In chapter III, the orf456 gene previously identified as the CMS gene in pepper was transformed to the Chinese cabbage (Brassica rapa L.) to gain further insights into this gene function. Among 30 T1 transgenic Chinese cabbage lines obtained approximately 50% of T1 transgenic lines showed male sterility. Nevertheless, how the orf456 gene precisely functions to induce male sterility and its biochemical function remain to be discovered.