Interaction between PD-L1 and EGFR, ERK1/2 in clear cell renal cell carcinoma

Abstract

Introduction: The interaction between the programmed cell death protein 1 (PD-1) and programmed death-ligand 1 (PD-L1) is known to suppress T cell function. The overexpressed PD-L1 in tumor cells inhibits the antitumor effect of the cytotoxic T cells by binding PD-1 on the tumor-infiltrating cytotoxic T cells, and then creates a favorable environment for the survival of tumor cells. Although the pathways involved in the expression of PD-L1 remain unclear, immunotherapy against PD-1 and PD-L1 has been tried in various malignant tumors, including renal cell carcinomas. Recent studies reported that activation of epidermal growth factor receptor (EGFR), and thereby activation of extracellular signal-regulated kinase (ERK), resulted in expression of PD-L1 in non-small cell lung cancer. Previous studies showed EGFR is overexpressed in clear cell renal cell carcinomas (CCRCC) and other studies showed phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2 (p-ERK1/2) and PD-L1 are also expressed in CCRCC. It is uncertain however what are roles of these key molecules in the growth of CCRCC and how they are regulated. In this study, I evaluated EGFR-ERK1/2-PD-L1 pathway in CCRCC to elucidate the significance of expression of PD-L1 in the activation of EGFR and ERK1/2.

Methods: To study signaling pathways involved in PD-L1 regulation mediated by p-ERK1/2, I performed western blot analysis for two human CCRCC cell lines, Caki-1 and Caki-2 after treatment with stimulant of ERK1/2 pathway, recombinant human epidermal growth factor or inhibitor of ERK1/2 pathway, U0126. I performed immunohistochemical staining for PD-L1, EGFR and p-ERK1/2 for 368 CCRCC surgical samples and analyzed the correlation between each degree of staining and clinicopathologic factors. To validate the immunohistochemical results of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples, I examined 16 fresh frozen CCRCC samples and analyzed the relationship of PD-L1 and p-ERK1/2 protein expression level by western blot analysis.

Results: I identified a change in PD-L1 expression upon artificial stimulation and inhibition of the ERK1/2 pathway in the Caki-1 CCRCC cell line by western blot analysis, although this was not observed in Caki-2 cell line. I also found a positive correlation between p-ERK1/2 expression and PD-L1 expression by immunohistochemical staining of FFPE samples. (Pearson r=0.324, p<0.001) I validated that relationship by western blot analysis of fresh frozen surgical samples. (Pearson r=0.748, p=0.001)

Conclusions: In this study, the ERK1/2-PD-L1 pathway was confirmed by in vitro and in vivo assay as a new mechanism of PD-L1 upregulation in CCRCC that has not been known until now. This would contribute to presenting a new mechanism of the pathogenesis of CCRCC by identifying the pathway involved in PD-L1 expression, and the combination of p-ERK1/2 and PD-L1 immunohistochemical staining could be used as a therapeutic response predictor for anti-PD-1/PD-L1 therapy in the future.

서론: Programmed cell death protein 1 (PD-1)과 그 리간드인 programmed death-ligand 1 (PD-L1)의 상호작용은 T세포 기능을 억제하는 것으로 알려져 있다. 종양세포에서 과발현된 PD-L1은 종양 침윤성 세포 독성 T세포의 PD-1과 결합하여 세포 독성 T 세포의 항종양 효과를 억제하고 종양세포의 생존에 유리한 환경을 조성한다. PD-L1의 발현에 관여하는 경로는 아직 불분명하지만, 신세포암을 포함한 다양한 악성 종양에서 PD-1과 PD-L1에 대한 면역요법이 효과를 보이고 있다. 한편 대표적인 종양 성장 촉진물질인 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 활성화 및 그로 인한 세포 외 신호 조절 인산화효소 (ERK)의 활성화가 비소세포폐암에서 PD-L1 발현 증가와 연관됨이 보고되었다. 투명세포 신세포암 (CCRCC)에서도 EGFR의 과발현이 50-90%에서 나타남이 알려져 있고, 인산화된 ERK1/2 (p-ERK1/2) 및 PD-L1 발현 역시 각각 알려져 있다. 그러나 이들 물질이 CCRCC에서 어떤 기전으로 상호 작용을 하고 조절되는지는 알려져 있지 않다. 본 연구는 CCRCC에서 EGFR-ERK1/2가 PD-L1에 미치는 영향과 조절경로를 조사하여 PD-L1의 발현이 EGFR과 ERK1/2의 활성화에 의해 유도되는지를 밝히고자 하였다.

방법: P-ERK1/2가 매개하는 PD-L1 조절에 관여하는 신호 전달 경로를 연구하기 위해 인간 CCRCC 세포주인 Caki-1 및 Caki-2를 대상으로 ERK1/2 경로의 자극제인 재조합 인간 상피 세포 성장 인자 (EGF)와 억제제인 U0126을 처리한 후 western blot 분석을 시행하였다. 또한 368례의 CCRCC 수술검체를 이용하여 PD-L1, EGFR, p-ERK1/2 면역 조직 화학 염색을 시행하였고 각각의 염색 정도와 임상 병리학적 인자들과의 상관관계를 분석하였다. 파라핀 샘플의 면역 조직 화학 염색 결과를 검증하기 위해 16개의 신선 냉동 CCRCC 샘플을 이용하여 western blot 분석을 통해 PD-L1과 p-ERK1/2 단백질 발현의 상관관계를 분석했다.

결과: 본 연구에서는 Caki-1 CCRCC 세포주를 대상으로 ERK1/2 경로의 자극 및 억제에 대한 PD-L1 발현의 변화를 western blot 분석으로 확인하였다. 이 변화는 Caki-2 세포주에서는 확인되지 않았다. 또한 파라핀 샘플의 면역 조직 화학 염색을 통해 p-ERK1/2 발현과 PD-L1 발현 사이의 양의 상관관계를 발견하였으며 (Pearson r=0.324, p<0.001) 신선 동결 수술 조직의 western blot 분석으로 그 상관관계를 재확인했다. (Pearson r=0.748, p=0.001)

결론: 이 연구를 통해 지금까지 알려지지 않았던 CCRCC에서의 PD-L1 발현의 새로운 기전으로 ERK1/2-PD-L1경로를 세포실험 및 생체조직 분석을 통해 확인하였다. 본 연구에서 확인한 CCRCC의 PD-L1 발현에 관여하는 ERK1/2 경로는 향후 CCRCC의 발병 기전의 새로운 과정을 밝히는데 이용될 것이며, p-ERK1/2 및 PD-L1 면역 조직 화학 염색 결과의 조합은 추후 항 PD-1/PD-L1 치료에 대한 반응 예측에 이용될 것이다.