PCR 증폭조건의 변화에 따른 증폭효능의 변화- Two-step PCR 증폭조건을 중심으로 -

Abstract

변화된 증폭조건은 증폭결과에 영향을 줄 수 있고 이에 대한 이해는 증폭결과를 향상시키는데 유용하게 활용될 수 있다. 예를 들어 미량의 DNA 시료나 PCR 억제제가 함유된 시료 등 일반적인 조건에서 결과를 얻기 어려운 경우 증폭효능을 향상시키기 위해 증폭조건을 변화시킬 수 있다. 한편 증폭조건의 변화는 전체적인 반응시간에 영향을 미칠 수도 있다. 이 논문에서는 기존에 많이 사용되고 있는 three-step PCR 방법을 변화시켜 annealing와 extension 과정을 결합한 two-step PCR 방법을 확립하고, 기존의 three-step PCR 방법과 비교하여 보고, 반응조건을 변화시켜가며 증폭결과를 관찰함으로써 법과학적 활용성을 검증하여 보고자 하였다. 법과학적으로 가장 흔히 사용되는 상업용 키트 가운데 하나인 AmpLSTR Identifiler® PCR Amplification Kit (Applied Biosystems) 를 사용하여 two-step PCR 방법과 three-step PCR 방법을 여러 농도의 시료나 부식산과 같은 억제제가 함유된 시료에 적용하여 증폭효능을 비교 분석하였다. 그리고 이러한 결과들을 이전에 발표된 여러 논문들과 비교하여 보았고, 이들을 참조하여 관련 기전을 추측하여 보고, 법과학적 활용성에 대해 고찰하여 보았다. 다양한 농도의 DNA에 대한 증폭결과를 분석하였는데, 그중 three-step PCR 방법에 비해 two-step PCR 결과에서 125 pg 시료에서 21 (8.5%) 개, 62.5 pg 시료에서 58 (23.6%) 개의 대립유전자가 더 많이 측정된 것을 볼 수 있었다. 그리하여 two-step PCR 방법은 다양한 농도의 시료에서 적용할 수 있음을 확인하였다. 한편, 부식산이 여러 정도의 농도로 포함되어 있는 경우, two-step PCR 방법을 적용한 증폭결과는 three-step PCR 결과에 비해 대립유전자의 소실 정도가 50 ng/ul 농도의 부식산 시료에서는 56 (22.7%) 개, 60 ng/ul 농도의 부식산 시료에서는 41 (17.1%) 개 적었다. 이러한 결과를 고려할 때 two-step PCR 증폭 조건이 억제제의 효과를 극복할 수 있는 한 방법일 수 있음을 알 수 있었다. Two-step PCR 방법은 부식산이 함유한 시료에서 더 좋은 증폭효능을 보였지만 PCR 방법이 갖는 여러 제한점들을 모두 극복할 수는 없었다. Two-step PCR 방법에서의 변화가 추가적인 영향을 가져올 수 있는지를 확인하여 보고자 annealing/extension 반응시간을 2분에서 6분까지 1분 간격으로 연장하면서 그 반응을 확인하여 보았다. 그 결과, 반응시간이 길어지면서 50 ng/ul 농도의 부식산을 함유한 시료에서는 평균적으로 234.5개에서 245개의 대립유전자가 확인 되였고, 60 ng/ul 농도의 부식산이 함유한 시료에서는 평균적으로 113개에서 242.5개의 대립유전자를 확인하였다. 반면에 반응시간이 6분보다 길어지면 위와 같은 긍정적인 현상은 포화상태에 이르게 되고, 이와 함께 대립유전자의 삽입과 같은 현상이 나타나기 시작하였다. 종합적으로 변화된 증폭조건은 증폭효능에서 기존의 방법과 유사하거나 경우에 따라 오히려 더 좋은 증폭효능을 보이기도 하였다. 이러한 결과는 여러 다양한 상황에서 다른 조건들과의 결합과 함께 추가적인 효과를 보일 가능성을 시사하고, 이와 같은 노력들은 LCN 시료들과 같이 일상적인 유전자 검사결과를 얻기 어려운 상황에서도 좀 더 의미 있는 결과를 생산할 방법을 제시할 수 있을 것으로 기대된다