ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ L-DOPA ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΑΣΗ ΑΠΟ ΤΙΣ ΛΕΥΚΕΣ ΝΥΜΦΕΣ ΤΟΥ ΕΝΤΟΜΟΥ CERATITIS CAPITATA ΚΑΙ ΑΠΟ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΝΕΦΡΙΚΟ ΙΣΤΟ. ΣΥΓΚΡ...

Abstract

L-DOPA DECARBOXYLASE IS A PYRIDOXAL PHOSPHATE-DEPENDENT ENZYME CATALYZING THE DECARBOXYLATION OF CERTAIN AROMATIC AMINO ACIDS TO THEIR RESPECTIVE AMINES. SINCE DOPAMINE IS INVOLVED IN MANY IMPORTANT METABOLIC PROCESSES PLAYING A CENTRAL ROLE IN THE PATHOGENESIS OF CERTAIN NEUROLOGICAL DISORDERS AND ON THE OTHER HAND O-DIPHENOLIC SUBSTANCES SUCH AS N-ACETYLODOPAMINE ARE INVOLVED IN SCLEROTIZATION OF INSECT CUTICLE, WE HAVE FOCUSED OUR ATTENTION ON THE PURIFICATION AND THE COMPARISON OF L-DOPA- DECARBOXYLASE FROM HUMAN AND INSECT TISSUES. USING STANDARD BIOCHEMICAL METHODOLOGY THE ENZYME HAS BEEN PURIFIED TO HOMOGENEITY FROM THE WHITE PREPUPAE LARVAE OF CERATITIS CAPITATA AS WELL AS FROM POST MORTEM HUMAN KIDNEY. COMPARISON OF THE RESULTS LEADS TO THE FOLLOWING CONCLUSION. 1. BOTH ENZYMES SHOW THE SAME MOLECULAR WEIGHT AND THE SAME DIMERIC STRUCTURE, CONSISTING OF TWO EQUAL SUBUNITS OF APPROXIMATELY 50.000. 2. ANTIBODIES RAISED IN RABBIT AGAINST THE PURIFIED HUMAN L-DOPA DECARBOXYLASE REACT WITH INSECT L-DOPA-DECARBOXYLASE AS JUDGED BY ELISA, AS WELL AS BY IMMUNOBLOTTING TECHNIQUES. IMMUNOPRECIPITATION OF THE ENZYME RESULTED IN A LOSS OF ACTIVITY CLEARLY SHOWING THAT ANTIBODIES AGAINST HUMAN L-DOPA DECARBOXYLASE ARE ALSO SPECIFIC FOR INSECT DOPADECARBOXYLASE. 3. HUMAN L-DOPA DECARBOXYLASE ACTIVITY IS HIGHLY DEPENDENTED ONTHE ADDITION OF EXOGENEOUS 5-PYRIDOXAL PHOSPHATE, REACHING A MAXIMAL 23-FOLD STIMULATION AT 400 MM PYRIDOXAL PHOSPHATE. INSECT L-DOPA DECARBOXYLASE ACTIVITY IS ONLY SLIGHTLY AFFECTED BY THE ADDITION OF EXOGENOUS 5-PYRIDOXAL PHOSPHATE. 4. THE EFFECT OF CATIONS ON ENZYMIC ACTIVITY IS COMPLETELY DIFFERENT IN THE TWO DECARBOXYLASES. HUMAN DECARBOXYLASE IS STRONGLY INHIBITED BY ZN2+, CU2+ AND HG2+ AND RATHER WEAKLY BY MG2+ AND CA2+. NONE OF THE ABOVE IONS EXHIBIT INHIBITORYEFFECT ON THE ENZYME PURIFIED FROM WHITE PREPUPAE. 5. HUMAN L-DOPA DECARBOXYLASE EXHIBITS A REMARKABLE SPECIFICITY TOWARDS L-DOPA AND AN AFFINITY FOR 5- HYDROXYTRYPTOPHAN. DOPA DECARBOXYLASE OF WHITE PREPUPAE SHOWS ABSOLUTE SPECIFICITY TOWARDS L-DOPA.

Η L-DOPA ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΑΣΗ ΕΙΝΑΙ ΕΝΑ ΕΝΖΥΜΟ ΠΟΥ Η ΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ ΤΗΝ ΦΩΣΦΟΡΙΚΗ ΠΑΡΕΜΒΟΛΗ ΚΑΙ ΤΟ ΟΠΟΙΟ ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΩΝΕΙ ΟΡΙΣΜΕΝΑ ΑΡΩΜΑΤΙΚΑ ΑΜΙΝΟΞΕΑ ΣΤΙΣ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΕΣ ΑΜΙΝΕΣ. ΔΕΔΟΜΕΝΟΥ ΟΤΙ Η ΝΤΟΠΑΜΙΝΗ ΣΥΜΜΕΤΕΧΕΙ ΣΕ ΠΑΡΑ ΠΟΛΛΕΣ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΕΣ ΔΙΕΡΓΑΣΙΕΣ ΕΧΟΝΤΑΣ ΕΝΑ ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΡΟΛΟ ΣΤΗΝ ΠΑΘΟΓΕΝΕΣΗ ΑΡΚΕΤΩΝ ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΚΩΝ ΔΙΑΤΑΡΑΧΩΝ, ΚΑΙ ΔΕΔΟΜΕΝΟΥ ΕΠΙΣΗΣ ΟΤΙ Ο- ΔΙΦΑΙΝΟΛΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΟΠΩΣ Η Ν-ΑΚΕΤΥΛΟΝΤΟΠΑΜΙΝΗ ΣΥΜΜΕΤΕΧΟΥΝ ΣΤΗΝ ΣΚΛΗΡΥΝΣΗ ΤΟΥ ΕΠΙΔΕΡΜΙΔΙΟΥ ΣΤΑ ΕΝΤΟΜΑ, ΕΧΟΥΜΕ ΕΣΤΙΑΣΕΙ ΤΗΝ ΠΡΟΣΟΧΗ ΜΑΣ ΣΤΟΝ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟ ΚΑΙ ΤΗ ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ L -DOPA ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΑΣΗ ΤΟΣΟ ΑΠΟ ΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΟΣΟ ΚΑΙ ΑΠΟ ΤΑ ΕΝΤΟΜΑ. ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΩΝΤΑΣ ΤΥΠΙΚΕΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΕΣ, ΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΕΧΕΙ ΚΑΘΑΡΙΣΤΕΙ ΣΕ ΟΜΟΓΕΝΗ ΜΟΡΦΗ ΤΟΣΟ ΑΠΟ ΤΙΣ ΛΕΥΚΕΣ ΝΥΜΦΕΣ ΤΟΥ ΕΝΤΟΜΟΥ CERATITIS CAPITATA ΟΣΟ ΚΑΙ ΑΠΟ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΝΕΦΡΙΚΟ ΙΣΤΟ ΠΟΥ ΛΑΜΒΑΝΕΤΑΙ ΜΕΤΑ ΘΑΝΑΤΟ. Η ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΟΔΗΓΕΙ ΣΤΑ ΑΚΟΛΟΥΘΑΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: 1. ΚΑΙ ΤΑ ΔΥΟ ΕΝΖΥΜΑ ΠΑΡΟΥΣΙΑΖΟΥΝ ΤΟ ΙΔΙΟ ΜΟΡΙΑΚΟ ΒΑΡΟΣ ΚΑΙ ΤΗΝ ΙΔΙΑ ΔΙΜΕΡΗ ΔΟΜΗ, ΣΥΝΙΣΤΑΝΤΑΙ ΔΕ ΑΠΟ ΔΥΟ ΥΠΟΜΟΝΑΔΕΣ ΜΟΡΙΑΚΟΥ ΒΑΡΟΥΣ 50.000 Η ΚΑΘΕ ΜΙΑ. 2. ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΤΑ ΟΠΟΙΑ ΑΝΑΠΤΥΧΘΗΚΑΝ ΣΕ ΚΟΥΝΕΛΙΑ ΕΝΑΝΤΙ ΤΗΣ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗΣ L-DOPA ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΑΣΗΣ ΠΟΥ ΑΠΟΜΟΝΩΘΗΚΕ ΑΝΤΙΔΡΟΥΝ, ΟΠΩΣ ΕΞΑΚΡΙΒΩΝΕΤΑΙ ΜΕ ΤΕΧΝΙΚΕΣELISA ΚΑΙ IMMUNOBLOTTING, ΚΑΙ ΜΕ ΤΑ ΔΥΟ ΕΝΖΥΜΑ ΚΑΙ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΔΡΑΣΤΙΚΗ ΜΕΙΩΣΗ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥΣ ΣΤΟ ΥΠΕΡΚΕΙΜΕΝΟ. 3. Η ΑΝΘΡΩΠΙΝΗΣΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ L- DOPA ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΑΣΗ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟΛΥΤΑ ΑΠΟ ΤΗΝ ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΕΞΩΓΕΝΟΥΣΦΩΣΦΟΡΙΚΗΣ ΠΥΡΙΔΟΞΥΛΑΣΗΣ. Η ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΜΕΓΙΣΤΟΠΟΙΕΙΤΑΙ ΠΑΡΟΥΣΙΑ 400 ΜΜ PLP ΚΑΙ ΑΥΞΑΝΕΤΑΙ ΚΑΤΑ 23 ΦΟΡΕΣ. Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΣΤΗΝ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑ ΤΗΣ L-DOPA ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΑ ΕΝΤΟΜΑ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΕΞΩΓΕΝΟΥΣ PLP ΕΠΗΡΕΑΖΕΤΑΙ ΕΛΑΧΙΣΤΑ. 4. Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΚΑΤΙΟΝΤΩΝ ΣΤΗΝ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑ ΕΙΝΑΙ ΕΝΤΕΛΩΣ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΗ ΣΤΙΣ ΔΥΟ ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΑΣΕΣ. ΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΑΠΟ ΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΑΝΑΣΤΕΛΕΤΑΙ ΙΣΧΥΡΑ ΑΠΟ ΙΟΝΤΑ ΖΝ2+, CU2+ ΚΑΙ HG2+ ΚΑΙ ΛΙΓΟΤΕΡΟ ΑΠΟ ΙΟΝΤΑ MG2+ ΚΑΙ CA2+. ΚΑΝΕΝΑ ΑΠΟ ΤΑ ΠΙΟ ΠΑΝΩ ΙΟΝΤΑ ΔΕΝ ΑΝΑΣΤΕΛΛΕΙ ΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΠΟΥ ΑΠΟΜΟΝΩΘΗΚΕ ΑΠΟ ΤΙΣ ΑΣΠΡΕΣ ΝΥΜΦΕΣΤΟΥ ΕΝΤΟΜΟΥ. 5. Η ΑΝΘΡΩΠΙΝΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ L-DOPA ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΑΣΗ ΠΑΡΟΥΣΙΑΖΕΙ ΑΞΙΟΣΗΜΕΙΩΤΗ ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΝΑΝΤΙ ΤΗΣ L-DOPA ΚΑΙ ΚΑΠΟΙΑ ΣΥΓΓΕΝΕΙΑ ΕΝΑΝΤΙ ΤΗΣ 5-ΗΤΡ. ΗL-DOPA ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΑΣΗ ΑΠΟ ΤΑ ΕΝΤΟΜΑ ΠΑΡΟΥΣΙΑΖΕΙ ΑΠΟΛΥΤΗ ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΝΑΝΤΙ ΤΗΣL-DOPA.