Μεταγωγή του σήματος από ακτιβίνη Α στα ενδοθηλιακά κύτταρα: διερεύνηση των μηχανισμών και διασύνδεση με την ενδοκυτταρική μεταφορά μεμβρανών

Abstract

TGFβ superfamily is comprised of a large number of growth factors, which play an important role in a variety of cellular functions. The common SMAD4 (co-SMAD), oligomerizes with receptor phosphorylated SMAD proteins (R-SMADs), and therefore constitutes an important component of the signal transduction of all members of this superfamily, and indeed is essential for propagation of the signal. In this thesis, in collaboration with Philippe Chavrier, SMAD4 was found to interact with ARF6 in a yeast-two-hybrid screen. This interaction was confirmed biochemically with pull-down and co- immunoprecipitation experiments. We expressed three forms of ARF6 (wild type WT, constitutively active Q67L mutant and GDP-bound inactive mutant T27N) and found that only the constitutively active form of ARF6 interacts with SMAD4. Moreover, we have shown that the ARF6Q67L-SMAD4 interaction is specific for ARF6: it was not observed with the constitutively active forms of ARF1 (ARF1Q71L) or ARF5 (ARF5Q71L), representatives of class I and II, of ARF GTPases, respectively. Subsequently, we addressed whether ARF6 interacts with the R-SMADS, SMAD2/SMAD3. Indeed, pull down experiments confirmed that ARF6Q67L associates with both SMAD2 and SMAD3. Further, co-immunoprecipitation experiments of ARF6Q67L, with either SMAD2, 3 or 4, showed that in the absence of TGFβ, SMAD2,3, and 4 proteins co-immunoprecipitated with ARF6Q67L, while in the presence of TGFβ, only SMAD3 co-immunoprecipitated. The above results were confirmed with the use of constitutively activated SMAD2 (EDME) and SMAD3 (EDVE), constructed by mimicking the receptor phosphorylation sites on both proteins. Indeed, ARF6Q67L co-immunoprecipitated SMAD3 (EDVE), while SMAD2 (EDME) was only marginally co-immunoprecipitated. In conclusion, SMAD4 and unphosphorylated SMAD2 and 3 (in the absence of ligand) are associated with ARF6Q67L, while in the presence of ligand, only SMAD3-P associates with ARF6Q67L. Domain mapping experiments of SMAD2, 3, and 4 mediating the association with ARF6Q67L were carried out. The SMAD4 domain responsible for the association with constitutively active ARF6Q67L is contained within the last 32-carboxy-terminal amino acids. In agreement, deletion of this domain in full length SMAD4 disrupted the interaction with ARF6Q67L. Furthermore, co-immunoprecipitation experiments of ARF6Q67L with SMAD2 and SMAD3 deletion constructs demonstrated that ARF6Q67L is associated with the last 40-carboxyterminal amino acids of SMAD2, as in the case of SMAD4, while the interaction domain of SMAD3 lies upstream. Due to the fact that ARF6Q67L physically associated with SMAD2 and SMAD3 in the absence of ligand, it was imperative to check the possibility that this association decreases, due to competitive binding, the availability of SMAD2 and SMAD3 proteins for phosphorylation from the ligand activated type I receptors. Thus, we investigated the effect of overexpressed ARF6 (WT, Q67L and T27N) on SMAD2 and SMAD3 phosphorylation induced by TGFβ and Activin A. In the presence of TGFβ, in FIUVE endothelial cells, as well as in embryonic renal 293 cells, we found that all forms of ARF6 dramatically reduced SMAD2 phosphorylation levels by approximately 80%. In the case of SMAD3, all forms of ARF6 reduced SMAD3 phosphorylation levels by approximately 40% following TGFβ. On the contrary, ARF6 did not influence the phosphorylation of SMAD2/SMAD3 induced by Activin A in FIUVE and 293 cells. The lack of ARF6 reduction of SMAD2 and SMAD3 phosphorylation upon Activin A addition indicates that the association of ARF6 with these SMADs does not influence their availability, due to competitive binding, for phosphorylation from activated type I receptor. In parallel, two other conclusions were drawn from previous experiments. First, the inhibition of SMAD2/3 phosphorylation (after TGFβ treatment) by ARF6wt, ARF6Q67L and ARF6T27N, could be attributed to the inhibition of TGFβ receptor endocytosis, a process which is considered essential so that SMAD2/3 are activated at the level of the early endocytic compartment. This specific activity of ARF6 is influenced by the cycle of its GTP-GDP exchange so that both constitutively active and constitutively inactive form of ARF6 have inhibitory action towards receptor endocytosis/recycling. The same has been reported to happen with the overexpressed ARF6wt as well, however the mechanism has not been clarified. Indeed, overexpression of ARNO protein (GEF of ARF6), which activates ARF6 without “locking” ARF6 in the GTP form, did not have any negative effect on SMAD2/3 phosphorylation upon TGFβ treatment. Second, the fact that SMAD2/3 phosphorylation upon Activin A is not influenced by ARF6wt, ARF6Q67L and ARF6T27N leads to the conclusion that either Activin A receptors are endocytosed via ARF6-independent processes, or that Activin A does not need endocytosis to phosphorylate SMAD2/3 proteins. A number of transcriptional regulation experiments led to the conclusion that the physical association of ARF6 and SMAD proteins, and its effect on phosphorylation through the inhibition of receptor phosphorylation, result in the inhibition of SMAD2 and SMAD3 transcriptional activity. Finally, we show that not only does the ARF6 activation status influence TGFβ superfamily signal transduction, but TGFβ also influences the level of ARF6 activation. In fact, our experimental data showed that within 20 min TGFβ converts ARF6 to the inactive form (GDP bound). Therefore, it appears that due to the ARF6-GTP inhibitory action on SMAD-dependent transcription, TGFβ maximizes its signal transduction by shifting ARF6 to its inactive GDP form. Therefore, our experimental data raise the possibility for further studies including detailed investigation of bidirectional interaction between ARF6 and TGFβ/Activin A, where the one system influences the functionality of the other.

Η υπεροικογένεια του TGFβ περιλαμβάνει ένα μεγάλο αριθμό αυξητικών παραγόντων, οι οποίοι παίζουν σημαντικό ρόλο σε πλειάδα λειτουργιών σε κυτταρικό, ιστικό και οργανισμικό επίπεδο. Σημαντικό συστατικό της μεταγωγής του σήματος όλων των μελών της υπεροικογένειας αυτής αποτελεί η κοινή SMAD4 (co-SMAD), η οποία ολιγομερίζεται με τις SMAD πρωτεΐνες οι οποίες φωσφορυλιώνονται από τους υποδοχείς (R-SMADs). Στη διατριβή αυτή εστιάσαμε την προσοχή μας σε μια πρώτη παρατήρηση, σε συνεργασία με τον Δρ. Philippe Chavrier, όπου η SMAD4 βρέθηκε να συνδέεται με την ARF6 στο σύστημα δύο υβριδίων σε ζυμομύκητα. Αρχικά, η αλληλεπίδραση αυτή επιβεβαιώθηκε βιοχημικά με πειράματα καταβύθισης και συν-ανοσοκατακρήμνισης από τα οποία προέκυψε ότι μεταξύ των τριών μορφών της ARF6 (φυσικού τύπου WT, μόνιμα ενεργής Q67L και μόνιμα ανενεργής Τ27Ν), οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν, μόνο η μόνιμα ενεργή μορφή της ARF6 αλληλεπιδρά με την SMAD4. Επιπροσθέτως, με πειράματα καταβύθισης σε 293 κύτταρα, δείχθηκε ότι η σύνδεση ARF6Q67L-SMAD4 είναι ειδική: δεν παρατηρήθηκε αλληλεπίδραση της SMAD4 με καμιά από τις ενεργές μορφές των ARF1 (ARF1Q71L) και ARF5 (ARF5Q71L) εκπροσώπων των τάξης I και II, των ARF GTPασών αντίστοιχα. Ακολούθως διερευνήθηκε η πιθανή φυσική σύνδεση της ARF6 με τις SMAD2/SMAD3 (R-SMADs). Πράγματι, πειράματα καταβύθισης επιβεβαίωσαν τη σύνδεση της ARF6Q67L με τις SMAD2 και SMAD3. Περαιτέρω πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης της ARF6Q67L, με καθεμία από τις SMAD2/3/4, έδειξαν ότι απουσία TGFβ, οι SMAD2/3/4 πρωτεΐνες ανοσοκατακρημνίζονται από την ARF6Q67L, ενώ παρουσία TGFβ, μόνο η SMAD3 ανοσοκατακρημνίζεται. Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με την χρήση μόνιμα ενεργοποιημένων SMAD2(EDME) και SMAD3(EDVE), όπου οι καρβοξυτελικές σερίνες που φωσφορυλιώνονται από τον υποδοχέα -SSXS- μεταλλάχθηκαν σε γλουταμινικά και ασπαρτικό, ως -EDME- και -EDVE-. Πράγματι, η ARF6Q67L ανοσοκατακρήμνισε με καλή απόδοση την SMAD3(EDVE), ενώ μόνο οριακά την SMAD2(EDME). Συμπερασματικά, οι μη φωσφορυλιωμένες SMAD2, SMAD3 και SMAD4 (απουσία προσδέματος) συνδέονται με την ARF6Q67L, ενώ παρουσία προσδέματος μόνο η SMAD3-P συνδέεται με την ARF6Q67L. Αμέσως μετά πραγματοποιήθηκαν πειράματα χαρτογράφησης των δομικών περιοχών των SMAD2/3/4 οι οποίες είναι υπεύθυνες για τη σύνδεση με την ARF6Q67L. Με καταβύθιση εντοπίστηκε η περιοχή της SMAD4 πρωτεΐνης η οποία είναι υπεύθυνη για την φυσική σύνδεση με την μόνιμα ενεργή μορφή της ARF6. Πρόκειται για τα 32-καρβοξυτελικά αμινοξέα της SMAD4 πρωτεΐνης, τα οποία είναι επαρκή για την διαμεσολάβηση της σύνδεσης με την ARF6. Επιπλέον, απάλειψη των 43-καρβοξυτελικών αμινοξέων είχε ως αποτέλεσμα την εξαφάνιση της σύνδεσης με την ARF6Q67L. Παραπέρα πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης ARF6Q67L με κατασκευές των SMAD2 και SMAD3 έδειξαν ότι η ARF6Q67L συνδέεται με τα τελευταία 40 καρβοξυτελικά αμινοξέα της SMAD2, όπως και στην περίπτωση της SMAD4, ενώ η περιοχή σύνδεσης με την SMAD3 βρίσκεται ανοδικά. Επειδή η ARF6Q67L συνδέεται φυσικά με τις SMAD2 και SMAD3 απουσία προσδέματος, ήταν επιβεβλημένο να ελεγχθεί η δυνατότητα η σύνδεση αυτή να μειώνει, λόγω ανταγωνιστικής δέσμευσης, τη διαθεσιμότητα των SMAD2 και SMAD3 πρωτεϊνών προς φωσφορυλίωση από τους ενεργοποιημένους από το πρόσδεμα τύπου I υποδοχείς. Έτσι, μελετήθηκε η επίδραση της υπερεκφρασμένης ARF6 (φυσικού τύπου WT, μόνιμα ενεργής Q67L και μόνιμα ανενεργής Τ27Ν) στη φωσφορυλίωση των SMAD2 και SMAD3 από τον TGFβ και την Ακτιβίνη Α. Παρουσία TGFβ, τόσο σε ενδοθηλιακά κύτταρα FIUVEC, όσο και σε εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα 293, δείχθηκε ότι η ARF6 (και οι τρεις μορφές της) προκαλεί δραματική μείωση των επιπέδων φωσφορυλίωσης της SMAD2 σε ποσοστό άνω του 80%. Αναφορικά με την SMAD3, η προκαλούμενη από την ARF6 (και από τις τρεις μορφές της) μείωση της από τον TGFβ προκαλούμενης φωσφορυλίωσής της ήταν επίσης σημαντική, περίπου 40%. Αντίθετα, η ARF6 (και οι τρεις μορφές της) δεν επηρέασε καθόλου την φωσφορυλίωση των SMAD2/SMAD3 από την Ακτιβίνη Α, σε FIUVEC και 293 κύτταρα. Η παντελής έλλειψη αρνητικής επίδρασης της ARF6 στην φωσφορυλίωση των SMAD2 και SMAD3 από την Ακτιβίνη Α υποδεικνύει ότι η σύνδεση της ARF6 με αυτές τις SMAD δεν επηρεάζει την διαθεσιμότητα τους, λόγω ανταγωνιστικής δέσμευσης, προς φωσφορυλίωση από τους ενεργοποιημένους τύπου I υποδοχείς. Παράλληλα όμως, από τα παραπάνω πειράματα εξήχθησαν και αλλά δύο συμπεράσματα. Πρώτο, η αναστολή της φωσφορυλίωσης των SMAD2/3 (μετά από χορήγηση TGFβ) από τις ARF6wt, ARF6Q67L και ARF6T27N πρέπει να οφείλεται στην αναστολή της ενδοκυττάρωσης των υποδοχέων του TGFβ, διαδικασία η οποία θεωρείται απαραίτητη προκειμένου να ενεργοποιηθούν οι SMAD2/3 στα πρώιμα ενδοσώματα. Αυτή ακριβώς η δραστικότητα της ARF6 επηρεάζεται από τον κύκλο της GTP-GDP μετατροπής της απαιτώντας συνεχείς κύκλους μετατροπής του GTP σε GDP με συνέπεια η μόνιμα ενεργή και η μόνιμα ανενεργή μορφή της ARF6 να έχουν αμφότερες ανασταλτική δραστικότητα στην ενδοκυττάρωση/ανακύκλωση υποδοχέων. Το ίδιο έχει αναφερθεί να συμβαίνει και με την υπερέκφραση της ARF6wt, αν και ο μηχανισμός δεν είναι διευκρινισμένος. Πράγματι, η υπερέκφραση της πρωτεΐνης ARNO (GEF της ARF6), η οποία ενεργοποιεί την ARF6 χωρίς να ‘κλειδώνει’ την ARF6 στην GTP μορφή, δεν είχε αρνητική επίδραση στη φωσφορυλίωση των SMAD2/3 από τον TGFβ. Δεύτερο, ο μη επηρεασμός της από την Ακτιβίνη Α επαγόμενης φωσφορυλίωσης των SMAD2/3 από τις ARF6wt, ARF6Q67L και ARF6T27N οδηγεί στο συμπέρασμα ότι είτε οι υποδοχείς της Ακτιβίνης Α ενδοκυτταρώνονται με διαδικασίες οι οποίες είναι ARFG-ανεξάρτητες, είτε οι υποδοχείς της Ακτιβίνης Α δεν χρειάζονται ενδοκυττάρωση για να φωσφορυλιώσουν τις SMAD2/3 πρωτεΐνες. Σειρά πειραμάτων μεταγραφικής ρύθμισης οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η φυσική σύνδεση της ARF6 με τις SMAD πρωτεΐνες, αλλά και η επίδρασή της στην φωσφορυλίωσή τους διαμέσου αναστολής της ενδοκυττάρωσης των υποδοχέων τους, έχει σαν αποτέλεσμα την καταστολή της μεταγραφικής δραστικότητας των SMAD2 και SMAD3. Τέλος δείξαμε ότι όχι μόνο η κατάσταση ενεργοποίησης της ARF6 επηρεάζει την μεταγωγή του σήματος από μέλη της οικογένειας του TGFβ, αλλά και η ενεργοποίηση των καθοδικών μονοπατιών του TGFβ επηρεάζει το επίπεδο ενεργοποίησης της ARF6. Πράγματι, τα πειραματικά μας δεδομένα έδειξαν ότι εντός 20 min ο TGFβ μετατρέπει ένα μεγάλο ποσό της ARF6 στην ανενεργή μορφή της (GDP προσδένουσα). Φαίνεται λοιπόν ότι λόγω της ανασταλτικής δραστικότητας της ARF6-GTP στη SMAD-εξαρτώμενη μεταγραφή, ο TGFβ μεγιστοποιεί την μεταγωγή των σημάτων του μετατρέποντας την ARF6 στην ανενεργή GDP μορφή της. Ανοίγει, λοιπόν, η δυνατότητα παραπέρα μελετών για την λεπτομερέστερη διερεύνηση της αμφίδρομης αλληλεπίδρασης μεταξύ της ARF6 και TGFβ/ακτιβίνης, όπου το ένα σύστημα επηρεάζει τη λειτουργικότητα του άλλου.