Μελέτη του μηχανισμού μεταγραφικής ρύθμισης του γονιδίου της μικρής GTPασης RHOB από το μονοπάτι του μετασχηματίζοντα αυξητικού παράγοντα β (TGFβ-1) και ο ρόλος της στις TGFβ-1- επαγώμενες αποκρίσεις του κυττάρου

Abstract

Rho proteins are characterized as molecular switches that control many cellular processes including actin and microtubule cytoskeleton organization, cell division, motility, cell adhesion, vesicular trafficking, phagocytosis and transcriptional regulation. Whereas the classical Rho GTPases are regulated by GDP/GTP cycling, in some cases transcriptional regulation, which determines the expression levels of the proteins in the cell, plays also a crucial role in their function. RhoB is the only member of the RhoA-related subfamily that is transcriptionally regulated and this regulation seems to be of high importance for its function due to the short half-life of this protein in the cell. The purpose of the present study was to investigate the mechanism of transcriptional induction of the small GTPase RhoB gene by the Transforming Growth Factor β (TGFβ-1) signaling pathway and the role of this regulation in TGFβ-1-induced cell responses such as cell migration, epithelial to mesenchymal transition (EMT) and cell growth. We found that TGFβ-1 induces a rapid and sustained increase in the mRNA and protein levels of the RhoB gene in various cell lines including human HaCaT keratinocytes, human hepatoblastoma HepG2 cells, human prostate cancer DU145 and PC3 cells and in mouse Swiss3T3 fibroblasts. We showed that the RhoB gene is a direct transcriptional target of TGFβ-1 in HaCaT cells. We found that this regulation is specific for the RhoB gene and is facilitated by the simultaneous activation of cytoplasmic Smad and MEK/ERK pathways.The early activation of the MEK/ERK pathway is required for the recruitment of Smad3 to a novel, non-classical, Smad binding element in the proximal RhoB promoter, in a p53-dependent manner. This element is overlapping with a CCAAT box that constitutively binds Nuclear Factor Y. Mutagenesis of this site abolished the Smad and NF-Y mediated transactivation of the RhoB promoter. Using siRNA-mediated silencing, inhibition of GTPase activity by dominant negative forms and adenovirus-mediated gene transfer we established that RhoB plays an important role in TGFβ-1-induced cell migration of HaCaT, DU145 and PC3 cells. Finally, we revealed a novel mechanism of cross-talk between the classical TGFβ-1 ?Smad pathway and Rho GTPases in which RhoB participates in an autoinhibitory loop of the TGFβ-1/Smad pathway. This mechanism explains the negative role of RhoB in the TGFβ-1-induced epithelial to mesenchymal transition and cell growth arrest. In conclusion, the specific induction of RhoB by TGF-β and its positive or negative role in TGF-β-induced cell responses indicate that RhoB could be a target for therapeutic intervention in malignant invasive tumors.

Οι Rho GTPάσες χαρακτηρίζονται ως υψηλά συντηρημένοι μοριακοί διακόπτες οι οποίοι εμπλέκονται σε πολλές από τις θεμελιώδεις διαδικασίες της βιολογίας του κυττάρου συμπεριλαμβανομένων της αναδιοργάνωσης του κυτταροσκελετού της ακτίνης και των μικροσωληνίσκων, του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης, της μετανάστευσης των κυττάρων, της ενδοκύτωσης, της φαγοκύτωσης και της μεταγραφικής ρύθμισης. Παράλληλα με τη ρύθμιση των Rho πρωτεϊνών μέσω εναλλαγής μεταξύ των GTP-ενεργών και GDP-ανενεργών μορφών τους, σημαντικό ρόλο για την όλη συμμετοχή τους στις αποκρίσεις των κυττάρων παίζει και η ρύθμιση στο επίπεδο της μεταγραφής, η οποία καθορίζει και τα επίπεδα έκφρασής τους στο κύτταρο. Η RhoB είναι το μόνο μέλος της RhoA υποοικογένειας το οποίο υφίσταται μεταγραφική ρύθμιση η οποία φαίνεται να είναι κεφαλαιώδους σημασίας για τη λειτουργία της λόγω του μικρού χρόνου ημίσειας ζωής της μέσα στο κύτταρο. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση και κατανόηση του μηχανισμού μεταγραφικής ενεργοποίησης του γονιδίου της μικρής GTPάσης RhoB από το μονοπάτι του TGFβ-1 και του ρόλου της ρύθμισης αυτής σε TGFβ-1-επαγώμενες αποκρίσεις του κυττάρου όπως η μετανάστευση, ο πολλαπλασιασμός αλλά και η διαδικασία της επιθηλιο-μεσεγχυματικής μετατροπής (ΕΜΤ) των κυττάρων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής, ο TGFβ-1 επάγει τη γρήγορη αλλά και μακροπρόθεσμη αύξηση των επιπέδων mRNA και πρωτεΐνης της RhoB σε διάφορες κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπινων κερατινοκυττάρων HaCaT, των ανθρώπινων κυττάρων ηπατοβλαστώματος HepG2, των καρκινικών κυττάρων προστάτη DU145 και PC3 και των ινοβλαστών ποντικού Swiss3T3. Διαπιστώθηκε ότι το γονίδιο της RhoB αποτελεί άμεσο μεταγραφικό στόχο του TGFβ-1 σε κύτταρα HaCaT. Η TGFβ-1-επαγώμενη μεταγραφική ρύθμιση αυτή αφορά αποκλειστικά το γονίδιο της RhoB και μεσολαβείται από την ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών των Smad και MEK/ERK πρωτεϊνών. Η γρήγορη επαγωγή του MEK/ERK μονοπατιού αλλά και η επακόλουθη φωσφορυλίωση της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης p53 χρειάζονται για τη στρατολόγηση της πρωτεΐνης Smad3 σε μια νέα, μη κλασική, αλληλουχία πρόσδεσης των πρωτεϊνών Smad στη κοντινή περιοχή του υποκινητή του γονιδίου της RhoB. Η αλληλουχία του RhoB υποκινητή στην οποία προσδένεται η πρωτεΐνη Smad3 αλληλοεπικαλύπτεται με ένα ρυθμιστικό στοιχείο CCAAT στο οποίο προσδένεται συστασιακά ο μεταγραφικός παράγοντας Nuclear Factor Y. Η μεταλλαξιγένεση της αλληλουχίας αυτής κατέστειλε την ενεργοποίηση του RhoB υποκινητή από τους παράγοντες Smad3 και NF-Y. Μέσω αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης RhoB με τη χρησιμοποιήση ειδικού siRNA και καταστολής της δράσης της μέσω υπερέκφρασης της επικρατούσας ανενεργής μορφής της διαπιστώθηκε ο σημαντικός ρόλος της πρωτεΐνης RhoB στην μετανάστευση των κυττάρων HaCaT, DU145 και PC3 ως απόκριση στον TGFβ-1. Τελικά, διαλευκάνθηκε ένας επιπλέον μηχανισμός συνεργατικής δράσης μεταξύ του TGFβ-1/Smad μονοπατιού και των Rho GTPασών ο οποίος βασίζεται στη συμμετοχή της πρωτεΐνης RhoB σε μηχανισμό αυτοαναστολής του TGFβ-1/Smad μονοπατιού. Ο μηχανισμός αυτός εξηγεί την ανασταλτική δράση της RhoB στην TGFβ-1-επαγώμενη επιθηλιο-μεσεγχυματική μετατροπή (ΕΜΤ) των κυττάρων και στο σταμάτημα του κυτταρικού πολλαπλασιασμού από τον TGFβ-1. Συμπερασματικά, ο θετικός ρόλος της στην επαγωγή της μετανάστευσης των κυττάρων από τον TGFβ-1, ο αρνητικός ρόλος της σε TGFβ-1-επαγώμενες κυτταρικές λειτουργίες όπως το σταμάτημα του πολλαπλασιασμού και η επιθηλιο-μεσεγχυματική μετατροπή και φυσικά η συμμετοχή της στο μηχανισμό αρνητικής αυτορύθμισης του TGFβ-1 μονοπατιού καθιστούν την πρωτεΐνη RhoB πολύπλοκο αλλά πολλά υποσχόμενο στόχο για την επίτευξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων στον καρκίνο και ενδεχομένως και σε άλλες ασθένειες.