Προέλευση του γονιδίου της αιμοσφαιρίνης S (HbS) στην Παλαιστίνη

Abstract

Sickle cell anaemia (SS) is an inherited chronic hemolytic disease due to a single point mutation substituting thymine for adenine at codon 6 of the β–globin gene. The high prevalence of the βˢ mutation in Africa, the Middle East, India and in parts of the Mediterranean has a relation to the selective protective effect of sickle cell hemoglobin (HbS) against malaria. Its spread to other regions of the world may be due to slave trade and/or population migration. The aim of the present study was; 1) To determine the origin of βˢ mutation among Palestinian patients with sickle cell disease. 2) To study the effect of haplotype on the haematological characteristics of sickle cell disease. 3) To further explore the causes of the variability in Hb F levels in sickle cell disease. 4) To explore how frequent and diverse are recombinations in chromosomes carrying the βˢ gene associated with common (or typical) haplotypes. 5) To study the genetic flow of sickle cell disease haplotypes among normal Palestinians (βᴬ chromosomes). 6) To assess the influence of thrombophilic mutations (factor V Leiden (G1691A) and Prothrombin (G20210A)) on the hypergoagability and thrombosis of sickle cell disease. Patients comprised 117 individuals with SCD, of whom 59 were SS (30 males and 29 females) aged 16 ± 9.9 years, 25 were AS (14 males and 11 females) aged 21.2 ± 9.1 years, and 33 were S/β thalassemia (18 males and 15 females) aged 15.1 ± 5.1 years. The control group was 78 apparently healthy individuals (57 males and 21 females) aged 20.6 ± 5.5 years. All patients came from different Palestinian cities and were all followed at the National Center for Blood Diseases “HIPPOCRATES”, Rammallah, Palestine. The β-globin gene cluster haplotypes were determined using the polymerase chain reaction restriction fragment-length polymorphism PCR-RFLP technique. For haplotype determination, 8 regions around and within the β-gene cluster were amplified by polymerase chain reaction. The 8 polymorphic restriction sites studied and the enzyme used in each case were: Hind II 5΄ to the ε gene, Xmn I 5΄ to the ᴳγ gene, Hind III within IVS-II of the ᴳγ and ᴬγ genes, Hind II 3΄ to ψβ gene, RsaI 5΄ to the β gene, AvaII for IVS-II of the β gene and HinfI 3΄ to the β gene. Genotyping of Thrombophilic mutations was carried out by (PCR-RFLP) using Mnl 1 and HindIII for FV-Leiden and prothrombin G20210A, respectively. One hundred seventy six (176) out of a total number of 234 chromosomes were βˢ, thirty-three (33) βThal, while twenty-five (25) had the wild type βᴬ gene. Four different typical haplotypes (Benin, Bantu, Cameroon, and Senegal) and four atypical ones (Bantu A2 (+----+++), Bantu A2c (+----++-), Bantu A2a (+----+-+) and Bantu A6a (--++-+-+)) were found in our patient population. The Benin haplotype was found to be the most prevalent in the study population in its heterozygous and homozygous states. This haplotype accounted for 82.4% of the homozygous form of the disease. The Bantu A2 atypical haplotype was the second most prevalent haplotype among our patients. The Bantu A2 haplotype accounted for 29.5% of the βᴬ haplotypes clarifying its high prevalence in our sample, and that it may be present a haplotype of normal population. Heterogeneity was observed in Hb F production in SS patients, ranging between (1.5-17%), whereas γᴳ ratio was homogeneous among all SS haplotypes with a normal amount of about (41%). Our results are in agreement with previous reports of the Benin haplotype origin in the Mediterranean. Thrombosis may play an important role in the pathophysiology of certain complications of sickle cell disease (SCD). Vascular complications such as ischemic stroke or deep vein thrombosis were diagnosed in seven patients. Age- and sexadjusted logistic regression analysis indicated a significant association between factor V Leiden mutation and sickle cell anemia with an odds ratios (OR) of 0.33 (95% confidence intervals [CI] of 0.12–0.94, P = 0.039) in SS patients. However, increased prevalence of the factor V Leiden in AS individuals and sickle/β-thalassemia patients was not statistically significant compared to controls. The prevalence of prothrombin G20210A mutation was not different between patients and controls, thereby giving no support to an association of single-point mutation with SCD. Although each of these mutations is relatively common in SCD, neither is independently associated with an increased risk of developing thrombophilic complications. This suggested a low impact of inherited hypercoagulability risk factors in the pathogenesis of SCD and/or its complications in Palestine.

Η δρεπανοκυτταρική αναιμία (SS) αποτελεί μία κληρονομούμενη χρόνια αιμολυτική νόσο, που οφείλεται σε σημειακή μετάλλαξη αντικατάστασης της θυμίνης από αδενίνη στο κωδίκιο 6 του γονιδίου της β-σφαιρίνης. Ο υψηλός επιπολασμός της μετάλλαξης βˢ στην Αφρική, στη Μέση Ανατολή, στην Ινδία και σε ορισμένες περιοχές της Μεσογείου συσχετίζεται με την επιλεκτική προστατευτική επίδραση της δρεπανοκυτταρικής αιμοσφαιρίνης (HbS) έναντι της ελονοσίας. Η διασπορά της και σε άλλες περιοχές παγκοσμίως μπορεί να οφείλεται στο δουλεμπόριο ή/και στη μετανάστευση πληθυσμιακών ομάδων. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι: 1) Ο προσδιορισμός της προέλευσης της μετάλλαξης βˢ σε Παλαιστίνιους ασθενείς με δρεπανοκυτταρική νόσο. 2) Η μελέτη της επίδρασης του απλότυπου στα αιματολογικά χαρακτηριστικά της νόσου. 3) Η περαιτέρω έρευνα των αιτιολογικών παραγόντων στη διαφορά των επιπέδων της εμβρυϊκής Hb (Hb F) στη δρεπανοκυτταρική νόσο. 4) Η διερεύνηση της συχνότητας και της διαφορετικότητας των ανασυνδυασμών στα χρωμοσώματα που φέρουν το γονίδιο βˢ που σχετίζονται με τους συχνούς (τυπικούς) απλότυπους. 5) Η μελέτη της γενετικής ροής των απλοτύπων της δρεπανοκυτταρικής νόσου σε φυσιολογικά άτομα στη Παλαιστίνη (βᴬ χρωμοσώματα). 6) Ο προσδιορισμός της επίδρασης των θρομβοφιλικών μεταλλάξεων (παράγοντας V Leiden (G1691A) και προθρομβίνη (G20210A) στην υπερπηκτικότητα και εμφάνιση θρομβώσεων στη δρεπανοκυτταρική νόσο. Το δείγμα αποτέλεσαν 117 ασθενείς με SCD, εκ των οποίων οι 59 ήταν SS (30 άρρενες και 29 θήλυ) με μέση ηλικία 16 ± 9.9 έτη, οι 25 ήταν AS (14 άρρενες και 11 θήλυ) με μέση ηλικία 21.2 ± 9.1 έτη, και τέλος οι 33 ήταν S/β θαλασσαιμία (18 άρρενες και 15 θήλυ) με μέση ηλικία 15.1 ± 5.1 έτη. Η ομάδα ελέγχου απαρτίζονταν από 78 υγιή άτομα (57 άντρες και 21 γυναίκες) με μέση ηλικία 20.6 ± 5.5 έτη. Να σημειωθεί ότι όλοι οι ασθενείς προέρχονταν από διαφορετικές πόλεις της Παλαιστίνης και παρακολουθούνταν όλοι στο Εθνικό Κέντρο Αιματολογικών Νοσημάτων «Ιπποκράτης» στη πόλη της Ραμάλα της Παλαιστίνης. Οι απλότυποι του γονιδίου της β-σφαιρίνης προσδιορίστηκαν με την μέθοδο της PCR και ανίχνευση πολυμορφισμών μήκους θραύσματος από περιοριστικό ένζυμο (PCR-RFLP), με ειδικά ένζυμα περιορισμού. Για τον προσδιορισμό των απλοτύπων, 8 περιοριστικές θέσεις γύρω και μέσα στη γονιδιακή περιοχή του β-γονιδίου πολλαπλασιάστηκαν με PCR. Οι 8 πολυμορφικές περιοριστικές θέσεις και τα αντίστοιχα περιοριστικά ένζυμα που χρησιμοποιήθηκαν, είναι τα εξής παρακάτω: το ένζυμο Hind II 5΄ για το γονίδιο ε , το Xmn I 5΄ για το ᴳγ γονίδιο, το Hind III για την ενδιάμεση αλληλουχία IVS-II των ᴳγ και ᴬγ γονιδίων, το Hind II 3΄για το ψβ γονίδιο, το RsaI 5΄ για το β γονίδιο, το AvaII για τη περιοχή IVS-II του β γονιδίου, και τέλος το HinfI 3΄ για το β γονίδιο. Ο προσδιορισμός των θρομβοφιλικών μεταλλάξεων πραγματοποιήθηκε με PCR-RFLP χρησιμοποιώντας τα περιοριστικά ένζυμα Mnl 1 και HindIII για τη μετάλλαξη του παράγοντα FV-Leiden και της προθρομβίνης G20210A, αντίστοιχα. Από το σύνολο των 234 χρωμοσωμάτων, τα 176 ήταν βˢ, τα 33 β-θαλασσαιμία, ενώ 25 έφεραν το φυσιολογικό γονίδιο βᴬ. Τέσσερις τυπικοί απλότυποι (Benin, Bantu, Cameroon και Senegal) και τέσσερις άτυποι (Bantu A2 (+----+++), Bantu A2c (+----++-), Bantu A2a (+----+-+) και Bantu A6a (--++-+-+)) ανευρέθηκαν στο δείγμα της μελέτης μας. Ο απλότυπος Benin ήταν ο επικρατέστερος τόσο στην ετερόζυγη όσο και στην ομόζυγη μορφή του. Επιπρόσθετα, ο απλότυπος αυτός βρέθηκε στο 82.4% των ομόζυγων μορφών της νόσου. Ο άτυπος απλότυπος Bantu A2 ήταν ο δεύτερος συχνότερος απλότυπος στο δείγμα των ασθενών μας. Συγκεκριμένα ο απλότυπος Bantu A2 αντιστοιχεί στο 29.5% των βᴬ απλοτύπων, εξηγώντας τον υψηλό επιπολασμό στο δείγμα μας και από την παρουσία του και στο φυσιολογικό πληθυσμό. Η ετερογένεια που παρατηρήθηκε στην παραγωγή της Hb F στους ασθενείς SS, κυμαίνονταν μεταξύ 1.5 και 17%, ενώ ο λόγος γᴳ ήταν ομοιογενής ανάμεσα στους SS ασθενείς, με φυσιολογικές τιμές να κυμαίνονται περίπου στο 41%. Τα αποτελέσματά μας είναι σε συμφωνία με προϋπάρχουσες έρευνες για την προέλευση του απλότυπου Benin στη Μεσόγειο. Η θρόμβωση πιθανόν παίζει πρωτεύοντα ρόλο στην παθοφυσιολογία ορισμένων επιπλοκών της δρεπανοκυτταρικής νόσου (SCD). Οι αγγειακές επιπλοκές, όπως το ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο και η εν τω βάθει φλεβική θρόμβωση διαγνώσθηκαν σε 7 ασθενείς στη μελέτη μας. Η σταθμισμένη για ηλικία και φύλο ανάλυση (λογιστική παλινδρόμιση) έδειξε μία σημαντική συσχέτιση μεταξύ της μετάλλαξης του παράγοντα V Leiden και της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας με odds ratios (OR) 0.33 (95% διαστήματα εμπιστοσύνης-confidence intervals [CI] 0.12–0.94, P = 0.039) σε SS ασθενείς. Εντούτοις, η διαφορά του υψηλού επιπολασμού του παράγοντα V Leiden σε AS άτομα και σε sickle/β-θαλασσαιμία ασθενείς δεν ήταν στατιστικώς σημαντική σε σχέση με τους μάρτυρες. Ο επιπολασμός της μετάλλαξης της προθρομβίνης G20210A δεν ήταν σημαντικά διαφορετικός ανάμεσα στους ασθενείς και στους μάρτυρες, απορρίπτοντας την υπόθεση της συσχέτισης της μετάλλαξης αυτής με τη δρεπανοκυτταρική νόσο SCD. Αν και οι μεταλλάξεις αυτές είναι αρκετά συχνές στη SCD, καμία δεν συσχετίστηκε ανεξάρτητα με αυξημένο κίνδυνο θρομβοφιλικών επιπλοκών. Τα αποτελέσματα αυτά προτείνουν τη χαμηλή επίδραση των κληρονομούμενων παραγόντων κινδύνου για υπερπηκτικότητα στην παθογένεια της δρεπανοκυτταρικής νόσου ή/και στις επιπλοκές αυτής, στην Παλαιστίνη.