Βιοχημική και μοριακή διερεύνηση της επίδρασης των μεταλλαγών ανθεκτικότητας στα τριαζολικά μυκητοκτόνα στην παραγωγή μυκοτοξινών από μύκητες του γένους aspergillus

Abstract

Mutants of the mycotoxigenic fungi Aspergillus parasiticus Speare and Aspergillus westerdijkiae Frisvad and Samson, moderately resistant to azole fungicides were isolated after UV-mutagenesis and selection on media containing flusilazole and epoxiconazole respectively. Studies on the effect of mutation(s) on the mycotoxin production resulted in the identification of two resistant phenotypes: mycotoxigenic, (afl+ in A. parasiticus and och+ in A. westerdijkiae) and non-mycotoxigenic (afl- in A. parasiticus and och- in A. westerdijkiae) mutant strains. All aflatoxigenic mutant isolates of A. parasiticus studied, produced on artificial medium aflatoxins at higher concentrations (115.4 - 189.7 % in total aflatoxin production) compared to the wild-type parent strain. A further increase in aflatoxin production was observed in ZG8 resistant strain when grown on flusilazole-amended medium (95.3 %). High aflatoxin concentrations (426.5% increase in total aflatoxin production) compared to the wild-type were also found in ZG11 mutant strain, after inoculation on wheat grains. In the case of A. westerdijkiae mutant strains, a negative correlation between fungicide resistance and ochratoxin production was found, both on artificial medium and on wheat grains. Study of fitness parameters in A. parasiticus mutant isolates, showed that resistance mutation(s) negatively affected the phenotypic fitness characteristics, such as the radial growth, the conidiation and mycelia production in the non aflatoxigenic isolates (afl-). The values of the above fitness parameters were significantly lower in all the non aflatoxigenic (afl-) mutants compared to the aflatoxigenic (afl+) and the wild-type parent strain. On the other hand, the fungicide resistance mutation(s) in A. westerdijkiae were found to affect or not to affect these ecological fitness parameters. Cross-resistance studies with other fungicides, showed that azole resistance mutation(s) caused a reduction in sensitivity of all A. parasiticus mutant strains, also to the triazole tebuconazole and the imidazole imazalil from the DMI group. Moreover, a multi-drug resistance of the A. parasiticus non-aflatoxigenic isolates (afl-) to chemically unrelated fungicides, as the benzimidazole benomyl, the anilinopyrimidine cyprodinil, the phenylpyridinamine fluazinam and the fungicides from the aromatic hydrocarbons and dicarboxamide group (AHDs) iprodione and tolclofos-methyl, was observed. In the case of A. westerdijkiae, all mutant strains studied exhibited reduced sensitivity to the DMIs flusilazole, difenoconazole and imazalil, while in the majority of them a reduction in sensitivity to other chemically unrelated site specific inhibitors as fenpropimorph (morpholine), fludioxonil, iprodione, cyprodinil, fluazinam, boscalid (carboxamide) and pyraclostrobil (Qo inhibitor) was also found. No effect in the sensitivity to the benzimidazole carbendazim and a negative cross-resistance relationship with the non-specific inhibitor chlorothalonil were observed in all mutant strains of A. westerdijkiae. Study of DMI resistance in A. parasiticus and A. westerdijkiae at the molecular level resulted in the identification of two different homologue genes (Cyp51A and Cyp51B) encoding 14 a- sterol demethylase enzymes and one gene (mdr) encoding an ATP-binding cassette (ABC) protein, in the wild type and resistant strains of both fungal species. Nucleotide sequence analysis of the Cyp51A gene in the aflatoxigenic ZG8 and ZB1 mutant strains of A. parasiticus, showed a glycine (GGG) to tryptophan (TGG) replacement at a position (G54W) involved in triazole resistance in other Aspergillus species. No other amino acid variation at positions known for triazole resistance was found in A. parasiticus and A. westerdijkiae mutant strains. Real-time PCR analysis in A. parasiticus mutant isolates, indicated high levels of constitutive transcription of the Cyp51A gene in the aflatoxigenic strain ZG11 and the mdr gene in the multidrug resistant isolates tested, compared to the wild-type parent strain. Differentiations in Cyp51A and mdr genes expression were also found in A. westerdijkiae mutant strains. In order to elucidate the relationship between DMI resistance and aflatoxin production, the aflatoxin biosynthetic pathway regulatory gene aflR, was isolated and gene expression levels were measured in A. parasiticus wild-type and mutant strains. The aflR gene was expressed only in the wild-type and the aflatoxigenic resistant isolates, while lack of gene expression in the non-aflatoxigenic strains was observed. This is the first report describing the existence of two homologue genes coding for 14a- sterol demethylase and a gene coding for an ABC transporter protein in both A. parasiticus and A. westerdijkiae fungal strains. This study also establishes for a first time a possible correlation between DMI resistance and aflatoxin production through the expression of the aflR gene. The data of the present study indicate the existence of three different fungicide resistance mechanisms (mutations in the target gene Cyp51, overexpression of the Cyp51 gene and energy-dependent drug efflux), in A. parasiticus and A. westerdijkiae, and highlight the potential risk of increased mycotoxin contamination of agricultural products by the appearance and predominance of highly mycotoxigenic mutant strains resistant to azole fungicides.

Στελέχη των μυκοτοξικογόνων μυκήτων Aspergillus parasiticus Speare και Aspergillus westerdijkiae Frisvad and Samson, με μέσο επίπεδο ανθεκτικότητας στα τριαζολικά μυκητοκτόνα, απομονώθηκαν μετά από μεταλλαξιγένεση με UV ακτινοβολία και επιλογή σε υλικό που περιείχε flusilazole και epoxiconazole, αντίστοιχα. Διερεύνηση της επίδρασης των μεταλλαγών ανθεκτικότητας στην ικανότητα παραγωγής μυκοτοξινών, έδειξε την ύπαρξη δυο φαινοτυπικών κατηγοριών μεταλλαγμένων στελεχών: μυκοτοξικογόνα (afl+ στον A. parasiticus και och+ στον A. westerdijkiae) και μη μυκοτοξικογόνα στελέχη (afl- στον A. parasiticus και ochστον A. westerdijkiae). Όλα τα αφλατοξικογόνα στελέχη του A. parasiticus που μελετήθηκαν, παρήγαγαν σε τεχνητό θρεπτικό υλικό αφλατοξίνες σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες (115,4 - 189,7 % ως προς τη συνολική παραγωγή αφλατοξινών) σε σύγκριση με το άγριο στέλεχος. Χαρακτηριστικό είναι επίσης το γεγονός ότι στο αφλατοξικογόνο στέλεχος ZG8, παρουσία flusilazole στο υλικό ανάπτυξης παρατηρήθηκε επιπλέον αύξηση των παραγόμενων ποσοτήτων αφλατοξινών (αύξηση 95,3 %). Στο αφλατοξικογόνο στέλεχος ZG11, παρατηρήθηκε αυξημένη παραγωγή αφλατοξινών και μετά από μόλυνση σε σπόρους σιταριού (αύξηση 426,5% ως προς τη συνολική συγκέντρωση των αφλατοξινών), σε σύγκριση με το άγριο στέλεχος. Στην περίπτωση των ανθεκτικών στελεχών του A. westerdijkiae, διαπιστώθηκε αρνητική επίδραση των μεταλλαγών για ανθεκτικότητα στην ικανότητα παραγωγής ωχρατοξινών, τόσο σε τεχνητό θρεπτικό υλικό, όσο και σε σπόρους σιταριού. Μελέτη της προσαρμοστικότητας των ανθεκτικών στελεχών του A. parasiticus, έδειξε ότι οι μεταλλαγές για ανθεκτικότητα κατά κανόνα επηρεάζουν αρνητικά τα χαρακτηριστικά προσαρμοστικότητας στα μη αφλατοξικογόνα στελέχη (afl-), όσον αφορά παραμέτρους όπως η γραμμική ανάπτυξη του μυκηλίου, η παραγωγή κονιδίων και ξηρού βάρους μυκηλίου, σε σχέση τόσο με τα αφλατοξικογόνα στελέχη (afl+), όσο και με το άγριο στέλεχος. Στην περίπτωση των ανθεκτικών στελεχών του Α. westerdijkiae, διαπιστώθηκε ότι οι μεταλλαγές για ανθεκτικότητα μπορεί να επηρεάσουν ή να μην επηρεάσουν τις παραμέτρους προσαρμοστικότητας. Πειράματα διασταυρωτής ανθεκτικότητας με άλλα μυκητοκτοκτόνα, έδειξαν ότι οι μεταλλαγές για ανθεκτικότητα μπορεί να προκαλέσουν μείωση της ευαισθησίας των ανθεκτικών στελεχών του A. parasiticus και σε άλλους παρεμποδιστές της βιοσύνθεσης εργοστερόλης της ομάδας των DMIs, όπως το τριαζολικό μυκητοκτόνο tebuconazole και το ιμιδαζολικό imazalil. Επιπλέον, στα μη αφλατοξικογόνα στελέχη (afl-) παρατηρήθηκε εκδήλωση του φαινομένου της πολλαπλής ανθεκτικότητας, καθώς διαπιστώθηκε μείωση της ευαισθησίας σε μυκητοκτόνα από άλλες χημικές ομάδες, όπως το βενζιμιδαζολικό benomyl, το ανιλινοπυριμιδινικό cyprodinil, το φαινυλοπυριδιναμινικό fluazinam, καθώς και στα μυκητοκτόνα της ομάδας των αρωματικών υδρογονανθράκων και δικαρβοξιμιδικών (AHDs) iprodione και tolclofos-methyl. Οι μεταλλαγές για ανθεκτικότητα προκάλεσαν επίσης μείωση της ευαισθησίας των μεταλλαγμένων στελεχών του A. westerdijkiae στους DMIs flusilazole, difenoconazole και imazalil, ενώ στην πλειοψηφία των στελεχών διαπιστώθηκε επιπλέον μείωση της ευαισθησίας και σε εξειδικευμένους παρεμποδιστές από άλλες χημικές ομάδες όπως στα μυκητοκτόνα fenpropimorph (μορφολινικό), fludioxonil, iprodione, cyprodinil, fluazinam, boscalid (καρβοξαμιδικό) και pyraclostrobil (Qo παρεμποδιστής). Επιπλέον, σε όλα τα ανθεκτικά στελέχη του A. westerdijkiae, οι μεταλλαγές για ανθεκτικότητα δεν επηρέασαν την ευαισθησία των στελεχών στο βενζιμιδαζολικό carbendazim, ενώ παρατηρήθηκε η ύπαρξη αρνητικής διασταυρωτής ανθεκτικότητας στο μη εξειδικευμένο παρεμποδιστή chlorothalonil. Η διερεύνηση την ανθεκτικότητας των στελεχών των A. parasiticus και Α. westerdijkiae στους DMIs με μοριακές τεχνικές, είχε ως αποτέλεσμα τον εντοπισμό και την απομόνωση στα άγρια και τα μεταλλαγμένα στελέχη, δυο διαφορετικών ομόλογων γονιδίων {Cyp51A και Cyp51B), που κωδικοποιούν τη βιοσύνθεση του ενζύμου της 14α- απομεθυλάσης, καθώς και ενός γονιδίου (mdr) που κωδικοποιεί ABC πρωτεϊνικούς μεταφορείς. Η ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του γονιδίου Cyp51A στα αφλατοξικογόνα στελέχη ZG8 και ΖΒ1 του A. parasiticus, έδειξε την ύπαρξη αντικατάστασης του αμινοξέος γλυκίνη (GGG) από το αμινοξύ τρυπτοφάνη (TGG) σε θέση (G54W) που σχετίζεται με την ανθεκτικότητα στα τριαζολικά μυκητοκτόνα σε είδη του γένους Aspergillus. Καμία άλλη αμινοξική αλλαγή δεν διαπιστώθηκε στα μεταλλαγμένα στελέχη των parasiticus και A. westerdijkiae, σε θέσεις γνωστές για ανθεκτικότητα στους DMIs. Η μελέτη των σχετικών επιπέδων έκφρασης των γονιδίων στα ανθεκτικά στελέχη του A. parasiticus, με τη χρήση της τεχνικής της PCR πραγματικού χρόνου, έδειξε αυξημένα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου Cyp51A στο αφλατοξικογόνο στέλεχος ZG11, καθώς και του γονιδίου mdr στα στελέχη με πολλαπλή ανθεκτικότητα, σε σύγκριση με το άγριο στέλεχος. Η ύπαρξη διαφορών στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων Cyp51A and mdr, διαπιστώθηκε και σε ανθεκτικά στελέχη του A. westerdijkiae. Για τη διερεύνηση της επίδρασης των μεταλλαγών ανθεκτικότητας στην ικανότητα παραγωγής αφλατοξινών, πραγματοποιήθηκε απομόνωση και μελέτη της έκφρασης του ρυθμιστικού γονιδίου της βιοσύνθεσης των αφλατοξινών aflR, στο άγριο και τα ανθεκτικά στελέχη του A. parasiticus. Έκφραση του γονιδίου aflR διαπιστώθηκε μόνο στο άγριο και τα αφλατοξικογόνα ανθεκτικά στελέχη, ενώ απώλεια έκφρασης παρατηρήθηκε στα μη αφλατοξικογόνα στελέχη. Στην παρούσα διατριβή διαπιστώθηκε για πρώτη φορά η ύπαρξη δυο διαφορετικών ομόλογων γονιδίων που κωδικοποιούν τη βιοσύνθεση του ενζύμου της 14α- απομεθυλάσης, καθώς και ενός γονιδίου που κωδικοποιεί ABC πρωτεϊνικούς μεταφορείς, στα στελέχη τόσο του A. parasiticus όσο και του A. westerdijkiae. Επίσης διαπιστώθηκε για πρώτη φορά πιθανή συσχέτιση μεταξύ ανθεκτικότητας στους DMIs και παραγωγής αφλατοξινών, μέσω της έκφρασης του ρυθμιστικού γονιδίου aflR. Βάσει των αποτελεσμάτων της παρούσας μελέτης, προσδιορίστηκαν τρεις διαφορετικοί μηχανισμοί για ανθεκτικότητα στα είδη του γένους Aspergillus, η αλλαγή της θέσης δράσης μέσω της πρόκλησης σημειακών μεταλλαγών στο γονίδιο Cyp51A, η υπερέκφραση του γονιδίου Cyp51A καθώς και η λειτουργία του μηχανισμού της αυξημένης απέκκρισης, ενώ διαπιστώθηκε η ύπαρξη αυξημένου κινδύνου για την παρουσία μυκοτοξινών στα γεωργικά προϊόντα, μέσω της εμφάνισης και επικράτησης ανθεκτικών στα τριαζολικά μυκητοκτόνα στελεχών του γένους Aspergillus.