Μελέτη του βιολογικού ρόλου πρωτεϊνικών κινασών που φωσφορυλιώνουν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες αργινίνης-σερίνης

Abstract

The elucidation of the biological function(s) of SR protein kinases (SRPKs) that specifically modify SR or RS dipeptide motifs was the main goal of this doctoral dissertation. We have previously shown that SAFB1 interacts with the extended NH2- terminal domain of SRPK1a, an alternatively spliced form of SRPK1 and contains an insertion of 171 amino acids at its NH2-terminal domain. Using the same yeast two hybrid approach we observed a weaker interaction of the same domain of SRPK1a with p53. Following these observations, we noticed that a fraction of nuclear p53 bound to and co-localized with SAFB1. In agreement with previous studies, the nuclear matrix-associated fraction of p53 that co-localized with SAFB1 dramatically increased upon treatment of cells with genotoxic agents such as mithramycin or 5- fluorouracil. Binding of p53 to SAFB1 was shown to be functionally significant, since SAFB1 suppressed p53-mediated reporter gene expression in p53-null cells (K562) doubly transfected with p53 and SAFB1. In view of the fact that neither SAFB1 nor p53 are phosphorylated by SRPKs, we discuss the potential role of SRPK1a in regulating the assembly of SAFB1-based regulatory complexes, associated with the nuclear matrix. In a following step, we studied the effect of phosphorylation of the RS domain of LBR, on its structure and on its interaction with histone H3 and heterochromatic protein HP1. Association with RNA molecules or phosphorylation of the serine residues within the RS domain, by SRPK1, renders the NH2-terminal part of LBR soluble. Phosphorylation was found to promote binding of histone H3, whereas we did not observe any effect on HP1 association. Trying to understand the structural changes due to the phosphorylation of the RS domain we proceeded with molecular dynamics simulations. In this respect, the RS domain of human LBR, containing four subsequent RS dipeptides (RSRSRSRS), in ideal extended conformation, was initially subjected to energy minimization, followed by molecular dynamics simulations. The same approach was followed for the phosphorylated RS domain, in which all serines within the RS domain were considered to be phosphorylated. The results showed that phosphorylation causes a dramatic change in the configuration of the RS domain. More specifically the non-phosphorylated RS domain exhibits an a-helical structure which remains constant upon 200 ns simulations, whereas the phosphorylated RS domain exhibits an array of extended disordered conformations. As a-helices participate in protein-protein interactions and self-associations this may explain the self-precipitation of the NH₂-terminal parts of LBR in solution. Finally, using in vitro binding assays we demonstrated that phosphorylated protamine 1 binds specifically to the RS region of LBR. Immunofluorescence microscopy studies on several isolated spermiogenic cells during the elongation process clearly showed that protamine 1 and LBR exhibit the same peripheral, polarized distribution in the nucleus of elongating spermatids. In an attempt to determine more specifically which serine residue, within the RS domain of protamine 1, mediates its association with LBR, we constructed a set of protamine mutants, in which Ser⁹, Ser¹¹ and Ser¹³ were changed to Ala, and expressed them as GFP-fusion proteins in HeLa cells. Mutation of Ser⁹ to Ala completely abolished the interaction of protamine 1 with the NH2-terminal part of LBR, whereas mutation of Ser¹¹ and Ser¹³ to Ala had practically no effect on the protamine/LBR interaction. Furthermore, fluorescence microscopy studies showed that a significant fraction of Prm1(9A)-GFP mutant remained in the cytoplasm, whereas the localization of Prm1-GFP, Prm1(11A)- GFP and Prm1(13A)-GFP was exclusively nuclear. This implies that the interaction of protamine 1 with the NH₂-terminal part of LBR probably plays a significant role in the nuclear localization of protamine1.

Η μελέτη του βιολογικού ρόλου των SRPKs αποτέλεσε το θέμα αυτής της διδακτορικής διατριβής. Η εργασία μας κινήθηκε σε τρεις άξονες: • Ο πρώτος άξονας αφορούσε τις πιθανές αλληλεπιδράσεις της SRPK1a, η οποία αποτελεί προϊόν εναλλακτικού ματίσματος του ίδιου γονιδίου με την SRPK1 και περιέχει σε σχέση με την SRPK1 μία πρόσθετη ακολουθία 171 αμινοξέων στο Ν-τελικό της άκρο. Χρησιμοποιώντας το σύστημα των δύο υβριδίων βρήκαμε ότι η SRPK1a βρίσκεται σε σύμπλοκο με τις πρωτεΐνες p53 και SAFB1. Καμία από τις δύο αυτές πρωτεΐνες που βρέθηκαν να αλληλεπιδρούν με την SRPK1a δεν αποτελεί υπόστρωμα της κινάσης αφού και οι δύο στερούνται RS αλληλουχιών. Έτσι, σε μια πρώτη προσέγγιση αποφασίσαμε να ελέγξουμε αν υπάρχει κάποιου είδους συσχέτιση ανάμεσα στις πρωτεΐνες p53 και SAFB1. Η πρωτεΐνη SAFB1 έχει βρεθεί να είναι συνδεδεμένη στο μεγαλύτερο ποσοστό της με την πυρηνική μήτρα. Αντίθετα ένα σχετικά μικρό ποσοστό της πρωτεΐνης p53 φαίνεται να εντοπίζεται στον πυρήνα σε control HepG2 κύτταρα. Προσθήκη όμως στα κύτταρα κυτταροστατικών φαρμάκων, όπως μιθραμυκίνη και 5’ φθοροουρακίλη, έχει ως αποτέλεσμα την σημαντική αύξηση των επιπέδων του p53. Στη περίπτωση των κυττάρων που έχουν κατεργαστεί με μιθραμυκίνη ή 5’ φθοροουρακίλη το μεγαλύτερο ποσοστό της πρωτεΐνης p53 εντοπίζεται στον πυρήνα και μάλιστα ένα σημαντικό μέρος από την πυρηνική p53 βρίσκεται ενωμένο με την πυρηνική μήτρα. Επεκτείνοντας αυτές τις παρατηρήσεις, βρήκαμε ότι η καρβοξυτελική περιοχή της πρωτεΐνης SAFB1 αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη p53, ενώ με δοκιμασίες έμμεσου ανοσοφθορισμού παρατηρήθηκε σημαντική συνεντόπιση των p53 και SAFB1 σε HepG2 κύτταρα που είχαν κατεργαστεί με 5-φθοροουρακίλη ή μιθραμυκίνη. Γνωρίζοντας ότι μια από τις βασικές λειτουργίες της πρωτεΐνης p53 είναι η δραστικότητά της ως μεταγραφικός παράγοντας, ένα επόμενο ερώτημα που θελήσαμε να απαντήσουμε είναι εάν ο SAFB1 έχει κάποια επίδραση στην μεταγραφική ικανότητα του p53. Συνέκφραση p53 και SAFB1 στα Κ562 κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα μείωση στα επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου αναφοράς γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή της πρωτεΐνης SAFB1 στη ρύθμιση της μεταγραφικής ενεργότητας του p53. Τέλος στη διατριβή συζητείται ο πιθανός ρόλος της SRPK1a στη ρύθμιση της συγκρότησης ρυθμιστικών συμπλόκων που συνδέονται με την πυρηνική μήτρα. • Ο δεύτερος άξονας αφορούσε τη μελέτη της φωσφορυλίωσης του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR) από την SRPK1. Βρέθηκε ότι η φωσφορυλίωση του αμινοτελικού άκρου του LBR από την SRPK1 έχει το ίδιο αποτέλεσμα με αυτό που έχει η αλληλεπίδρασή του με μόρια RNA, αυξάνει δηλαδή την διαλυτότητά του. Το φωσφορυλιωμένο αμινοτελικό άκρο αλληλεπιδρά με την ιστόνη Η3, ενώ αντίθετα η φωσφορυλίωση δεν έχει καμμία επίδραση στην αλληλεπίδρασή του με την ετεροχρωματινική πρωτεΐνη HP1. Από τη μελέτη μας επίσης προέκυψε ένα πολύ ενδιαφέρον συμπέρασμα το οποίο πιθανά να δίνει και μια σφαιρική ερμηνεία για τον ρόλο της φωσφορυλίωσης ενός τόσο μεγάλου αριθμού ετερογενών πρωτεϊνών με διαφορετικές λειτουργικότητες και κυτταρική εντόπιση. Συγκεκριμένα προέκυψε ότι η μη φωσφορυλιωμένη RS ακολουθία εμφανίζει διαμόρφωση α-έλικας, ή οποία μάλιστα παραμένει και σταθερή, ενώ αντίθετα η φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας έχει ως αποτέλεσμα αυτή να λαμβάνει μια πληθώρα από τυχαίες αποδιαταγμένες διαμορφώσεις. Η δραματική αυτή αλλαγή στη διαμόρφωση πιθανά εξηγεί και την τάση δημιουργίας συσσωματωμάτων από τα μη φωσφορυλιωμένα αμινοτελικά άκρα. • Τέλος ο τρίτος άξονας αφορούσε τη φωσφορυλίωση της πρωταμίνης 1 από την SRPK1. Διαπιστώθηκε, με πειράματα συγκατακρήμνισης, ότι μόνο όταν η πρωταμίνη 1 είναι φωσφορυλιωμένη από την SRPK1 δεσμεύεται στην RS ακολουθία του LBR. Η αλληλεπίδραση αυτή επιβεβαιώνεται και με δοκιμασίες ανοσοφθορισμού σε τμήματα σπερματοφόρου σωληνίσκου ποντικού, όπου και διαπιστώθηκε ότι ο LBR και η πρωταμίνη 1, κατά την έναρξη της επιμήκυνσης των σπερματίδων, συνεντοπίζονται στην πυρηνική περιφέρεια. Μια σειρά από σημειακές μεταλλάξεις έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση της σερίνης 9 παίζει καθοριστικό ρόλο στην αλληλεπίδραση της πρωταμίνης 1 με το αμινοτελικό άκρο του LBR. Σε συνέχεια αυτής της παρατήρησης, δείξαμε ότι η απουσία αλληλεπίδρασης του μεταλλάγματος Prm1(9A)-GFP με το αμινοτελικό άκρο του LBR είχε επίδραση στην υποκυτταρική του εντόπιση. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε ότι ένα μέρος του μεταλλάγματος, μετά από υπερέκφρασή του σε HeLa κύτταρα παραμένει στο κυτταρόπλασμα. Πιθανά λοιπόν, σε κάποια έκταση, η αλληλεπίδραση της πρωταμίνης 1 με το αμινοτελικό άκρο του LBR να συνεισφέρει στην πυρηνική εντόπιση της πρωταμίνης.