Πειραματικά μοντέλα ανοσοθεραπείας HER-2/neu θετικών όγκων

Abstract

Overexpression of the HER-2/neu oncogene by a significant number of human carcinomas has been associated with more aggressive disease. Despite its high oncogenic potential, HER2/neu oncoprotein has been considered as a promising target for cancer therapeutics as it has been proven to be immunogenic in vivo inducing specific CTL and IgG responses in a considerable subset of patients with HER-2/neu positive breast cancer. Moreover, various MHC class I- and class II-binding peptides from the HER-2/neu sequence were also able to elicit in vitro tumor reactive CTL and T helper (Th) responses, respectively. However, synthetic peptides corresponding to HER-2/neu immunogenic epitopes have greatly failed to function as therapeutic vaccines in phase I/II trials. Due to the fact that HER-2/neu is a self-protein, tolerance mechanisms may provide a serious obstacle towards the development of efficient anti-tumor responses in vivo. In order to circumvent tolerance against the HER-2/neu protein, several approaches have been invented and applied in preclinical models, resulting in more persistent and efficient antitumor responses. However, in parallel with studies aiming at improving the effectiveness of a vaccine, it has been considered essential to identify novel immunogenic CTL epitopes, aiming at providing insight into the design of more efficacious peptide-based treatment modalities. This study describes a novel HLA-A*0201-restricted epitope, encompassing amino acids 828-836 (residues QIAKGMSYL), which is naturally presented by various HER-2/neu⁺ tumor cell lines. HER-2/neu(828-836), [HER-2(9₈₂₈)], possesses two anchor residues and stabilized HLA-A*0201 on T2 cells in a concentration-dependent class I binding assay. This peptide was stable for 3.5h in an off-kinetics assay. HER-2(9₈₂₈) was found to be immunogenic in HLAA*0201 transgenic (HHD) mice inducing peptide-specific and functionally potent CTL and lasting anti-tumor immunity. Most important, using HLA-A*0201 pentamer analysis we could detect increased ex vivo frequencies of CD8⁺ T lymphocytes specifically recognizing HER2(9₈₂₈) in eight out of twenty HLA-A*0201⁺ HER-2/neu⁺ breast cancer patients. Moreover, HER2(9₈₂₈)-specific human CTL recognized the tumor cell line SKOV3.A2 as well as the primary RS.A2.1.DR1 tumor cell line both expressing HER-2/neu and HLA-A*0201. Finally, therapeutic vaccination with HER-2(9₈₂₈) in HHD mice was proven effective against established transplantable ALC.A2.1.HER tumors, inducing complete tumor regression in 50% of mice. Our data encourage further exploitation of HER-2(9₈₂₈) as a promising candidate for peptide-based cancer vaccines. The necessity of CD4 T-cell help to generate and sustain MHC class I–restricted CD8 T-cell responses has led to the identification of a new MHC class II–restricted epitope derived from the human HER-2/neu protein, namely HER-2(15₈₂₂). This helper 15-mer peptide, which exhibits a very strong binding score with the HLA-DRB1*0101 (HLA-DR1) molecule (according to the SYFPEITHI database) encompasses the amino acid sequence of the cytotoxic epitope, HER2(9₈₂₈), which has been identified as a potent immunogenic peptide. By applying a vaccination protocol based on the administration of the HER-2(15₈₂₂) in the HLA-A2.1/HLA-DR1 mouse model, it was evident that this peptide was recognized not only by syngeneic splenocytes pulsed with the peptide but also by the primary cancer cell line RS.A2.1.DR1, which it has been shown to naturally express the HER-2(9₈₂₈). More importantly, therapeutic vaccination of the newly established HLA-A2.1/DR1 X neuT⁺ mouse model tolerant to rat neu and transgenic for HLAA*0201 and HLA-DRB1*0101 with the xenogeneic human HER-2(9₈₂₈) and HER-2(15₈₂₂) peptides has been found very successful. Vaccination with the HER-2(15₈₂₂) helper epitope (86% sequence homology with the rat peptide) induced a considerable delay of up to 8 weeks in spontaneous mammary tumor growth compared to the untreated mice (P=0.0001). Whereas vaccination of the same mice with the HER-2(9₈₂₈) cytotoxic peptide conferred a delay in tumor growth of a maximum 5 weeks compared to the untreated mice (P=0.0003). Based on the above findings one can conclude that HER-2(15₈₂₂) helper peptide is indeed immunogenic and capable of successfully enhancing the cytotoxic activity of HER-2(9₈₂₈) as seen in both in vitro and in vivo settings. In a supplementary study, by applying the same prediction algorithms for MHC class I ligands and proteosomal cleavages, we have been able to identify the HER-2/neu decamer LIAHNQVRQV spanning residues 85-94 [HER-2(10₈₅)]. HER-2(10₈₅) proved to bind with high affinity to HLA-A*0201 and was stable for 4 h in an off-kinetics assay. This peptide was immunogenic in HLA-A2.1 transgenic (HHD) mice inducing peptide-specific CTL, which responded to tumor cell lines of various origin co-expressing human HER-2/neu and HLAA*0201. This demonstrates that HER-2(10₈₅) is naturally processed from endogenous HER2/neu. Five of sixteen HER-2/neu + HLA-A*0201+ breast cancer patients analyzed, had HER2(10₈₅)-reactive T cells ranging from 0.35% to 0.70% of CD8⁺ T cells. Depletion of regulatory T (Treg) cells from PBMC enabled the rapid expansion of HLA-A*0201/HER2(1085)pentamer⁺/CD8⁺ cells (PENT⁺/CD8⁺), whereas significantly lower numbers of CTL could be generated from unfractionated PBMC. HER-2(1085)-specific human CTL recognized the HER-2/neu⁺ HLA-A*0201⁺ tumor cell line SKBR3.A2, as determined by IFN-γ intracellular staining and in the high-sensitivity CD107α degranulation assay. Finally, HER-2(10₈₅) significantly prolonged the survival of HHD mice inoculated with the transplantable ALC.A2.1.HER tumor both in prophylactic and therapeutic settings. These data demonstrate that HER-2(1085) is an immunogenic peptide, capable of eliciting CD8-mediated responses in vitro and in vivo, providing the platform for further exploitation of HER-2(10₈₅) as a possible target for anticancer immunotherapy.

Η υπερέκφραση της HER-2/neu ογκοπρωτεΐνης σε έναν σηµαντικό αριθµό ανθρώπινων καρκινωµάτων σχετίζεται µε την εκδήλωση σοβαρότητας της νόσου. Παρά, όµως, την υψηλή ογκο-ειδική ανοσογονικότητα της πρωτεΐνης, η HER-2/neu αποτελεί έναν πολλά υποσχόµενο στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου, λόγω της αποδεδειγµένης ανοσογονικότητάς του in vivo να επάγει ειδικές τόσο κυτταροτοξικές όσο και χυµικές απαντήσεις σε ένα σηµαντικό ποσοστό ασθενών µε καρκίνο του µαστού. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι πεπτιδικά εµβόλια προερχόµενα από την αλληλουχία της HER-2/neu τα οποία προσδένονται στα µόρια των τάξεων I και ΙΙ του MHC, ήταν σε θέση να επάγουν in vitro ειδικές για αυτά απαντήσεις κυτταροτοξικών (CD8⁺) και βοηθητικών (CD4⁺) Τ λεµφοκυττάρων. Παρόλα αυτά, ορισµένα συνθετικά πεπτίδια τα οποία αντιστοιχούν σε ανοσογόνους επίτοπους της HER-2/neu, αποδείχθηκαν ανεπιτυχή σε κλινικές δοκιµές φάσης Ι και ΙΙ. Λόγω της παρουσίας της HER-2/neu ως αυτό-αντιγόνου, οι διάφοροι µηχανισµοί ανοχής σε αυτή µπορούν να αποτελέσουν εµπόδιο για την ανάπτυξη επιτυχών απαντήσεων ενάντια στον όγκο in vivo. Για αυτό το σκοπό έχουν εφαρµοστεί διάφορες πειραµατικές προσεγγίσεις σε προ-κλινικά µοντέλα που αποσκοπούν στην υπερπήδηση της ανοχής στην ογκοπρωτεΐνη επιτυγχάνοντας πιο αποτελεσµατικές και διαρκείς απαντήσεις ενάντια στον όγκο. Παράλληλα µε αυτήν την προσέγγιση κρίνεται απαραίτητη η διαρκής ταυτοποίηση καινούργιων πεπτιδικών αλληλουχιών της HER-2/neu για το σχεδιασµό αποτελεσµατικότερων θεραπευτικών πρωτόκολλων εµβολιασµού. Το πεπτίδιο HER-2(9₈₂₈) (αµινοξιδικά κατάλοιπα 828-836, QIAKGMSYL) αποτελεί έναν επίτοπο της ογκοπρωτεΐνης HER-2/neu που µελετάται για πρώτη φορά, δύναται να συνδεθεί αποκλειστικά µε το HLA-A*0201 µόριο και αναγνωρίζεται από διάφορες HER-2/neu⁺ καρκινικές σειρές. Η ικανοποιητική ικανότητα πρόσδεσης του HER-2(9₈₂₈) µε το HLA-A*0201 µόριο αποδεικνύεται τόσο µε βάση τις λογαριθµικές βάσεις δεδοµένων που προβλέπουν την πρόσδεση πεπτιδίων µε το MHC (όπως το SYFPEITHI). αλλά και µε µεθόδους λειτουργικότητας (το σύµπλοκο MHC/πεπτίδιο παράµεινε σταθερό για 3.5 ώρες στην επιφάνεια των Τ2 κυττάρων). Κατά τον εµβολιασµό των διαγονιδιακών για το HLA-A*0201 HHD ποντικιών, το πεπτίδιο βρέθηκε να είναι ανοσογόνο και ικανό να επάγει ειδικά για αυτό κυτταροτοξικά Τ λεµφοκύτταρα (CTL) αλλά και να προσφέρει ανοσία µνήµης ενάντια στον όγκο. Παράλληλα, κατά τη µελέτη αυτή αποδεικνύεται η παρουσία αυξηµένων ex vivo CTL συχνοτήτων ειδικών για το πεπτίδιο στους οχτώ από τους είκοσι HLA-Α*0201+ ασθενείς µε καρκίνο του µαστού που υπερεκφράζουν την HER-2/neu. Τα αποτελέσµατα αυτά ενθαρρύνουν την περαιτέρω µελέτη και εφαρµογή του HER-2(9₈₂₈) πεπτιδίου στην έρευνα για την ανάπτυξη πεπτιδικών εµβολίων κατά του καρκίνου. Η ανάγκη για την αναζήτηση νέων βοηθητικών πεπτιδικών επίτοπων τα οποία θα ενισχύουν τη δράση των κυτταροτοξικών εµβολίων και κατ’επέκταση την ανοσολογική απάντηση του οργανισµού ενάντια στον αναπτυσσόµενο όγκο, οδήγησε στην ταυτοποίηση ενός βοηθητικού επίτοπου προερχόµενου από την αλληλουχία της ανθρώπινης HER-2/neu ογκοπρωτεΐνης, του HER-2(15₈₂₂). Το δεκαπενταµερές πεπτίδιο αυτό, όπως προκύπτει από τη βάση δεδοµένων SYFPEITHI, προσδένεται µε έναν πολύ ισχυρό δεσµό σύνδεσης µε το µόριο HLA-DRB1*0101 (HLA-DR1) και εµπεριέχει στην αλληλουχία του κυτταροτοξικό επίτοπο HER-2(9₈₂₈), του οποίου η ανοσογονικότητα έχει ήδη αποδειχθεί στην προηγούµενη πειραµατική µελέτη (Κεφάλαιο 4ο). Εφαρµόζοντας ένα κατάλληλο πρωτόκολλο εµβολιασµού µε το HER-2(15₈₂₂) σε διαγονιδιακά HLA-A2.1/HLA-DR1 ποντίκια, ήταν εµφανές ότι το πεπτίδιο αναγνωρίστηκε τόσο από προ-επωασµένα µε το πεπτίδιο ολικά σπληνοκύτταρα όσο και από την κυτταρική σειρά RS.A2.1.DR1. Πιο σηµαντικά, όµως, ο θεραπευτικός εµβολιασµός ενός νέου µοντέλου πειραµατόζωων, των HLA-A2.1/DR1 X neuT⁺ , τα οποία έχουν ανοχή στην neu πρωτεΐνη (rat neu του αρουραίου) και είναι διαγονιδιακά για τα HLA-A*0201 και HLA-DRB1*0101 αλλήλια, µε τα ξενογενή για αυτά πεπτίδια HER-2(9₈₂₈) και HER-2(15₈₂₂), επέφερε πολύ σηµαντικά αποτελέσµατα. Πιο συγκεκριµένα, ο εµβολιασµός µε το HER-2(15₈₂₂) το οποίο διαφέρει κατά δύο αµινοξέα από το αντίστοιχο πεπτίδιο του αρουραίου (86% αµινοξική οµολογία), ήταν ικανός να καθυστερήσει την εµφάνιση των αυτόχθονων όγκων µέχρι και 8 εβδοµάδες σε σχέση µε τα µη-εµβολιασµένα πειραµατόζωα (P=0,0001) ενισχύοντας τη δράση του κυτταροτοξικού επίτοπου HER-2(9₈₂₈), ο εµβολιασµός µε τον οποίο επέφερε µια καθυστέρηση στην ανάπτυξη των αυτόχθονων µαστικών όγκων για ένα µέγιστο διάστηµα 5 εβδοµάδων σε σχέση µε τα µηεµβολιασµένα πειραµατόζωα (P=0,0003). Με βάση τα παραπάνω µπορεί κανείς να οδηγηθεί στο συµπέρασµα ότι το πεπτίδιο HER-2(15₈₂₂) αποτελεί έναν αρκετά ανοσογόνο βοηθητικό επίτοπο, ο οποίος φαίνεται να ενισχύει επιτυχώς την κυτταροτοξική δράση του HER-2(9₈₂₈) πεπτιδίου. Επιπλέον, µέσα από µια συµπληρωµατική µελέτη, µε την εφαρµογή των ίδιων αλγόριθµων που προβλέπουν την πρόσδεση πεπτιδίων στο MHC I και την πρωτεολυτική τους διάσπαση, περιγράφεται η ταυτοποίηση ενός δεκαµερούς πεπτιδίου από την αλληλουχία της HER-2/neu (αµινοξικά κατάλοιπα LIAHNQVRQV), το οποίο καταλαµβάνει τα αµινοξέα 85-94 (HER2(10₈₅)). Το πεπτίδιο αυτό αποδείχθηκε ότι προσδένεται ισχυρά µε το HLA-A*0201 αλλήλιο σχηµατίζοντας ένα σταθερό σύµπλοκο για τουλάχιστον 4 ώρες. Επιπλέον το πεπτίδιο HER2(10₈₅) ήταν ικανό να επάγει ειδικές προς αυτό Τ κυτταροτοξικές απαντήσεις κατά τον εµβολιασµό διαγονιδιακών HHD πειραµατόζωων, κατά την αναγνώριση καρκινικών σειρών διαφορετικής προέλευσης, οι οποίες εκφράζουν τόσο την HER-2/neu όσο και το HLA-A*0201. Αυτή η παρατήρηση καταδεικνύει την ιδιότητα του HER-2(10₈₅) ως φυσικά απαντώµενου πεπτιδίου. Πέντε από τους συνολικά δεκάξι HER-2/neu⁺ HLA-A*0201⁺ ασθενείς µε καρκίνο του µαστού που µελετήθηκαν εµφάνισαν ποσοστά HER-2(10₈₅)- ενεργών CD8⁺ Τ κυττάρων κυµαινόµενα από 0.35 έως 0.70%. Απαλοιφή των Τ ρυθµιστικών κυττάρων από τα µονοπύρηνα περιφερικού αίµατος αυτών των ασθενών είχε σαν αποτέλεσµα την ενεργοποίηση ειδικών HLAA*0201/HER-2(10₈₅)pentamer⁺/CD8⁺ κυττάρων (PENT⁺/CD8⁺). Αντίθετα, όταν δεν έγινε απαλοιφή των ρυθµιστικών Τ κυττάρων, παρήχθηκαν χαµηλότερα ποσοστά ειδικών για το πεπτίδιο CTL κυττάρων στους ίδιους ασθενείς. Ανθρώπινα CTL ειδικά για το πεπτίδιο αναγνώρισαν την HER-2/neu⁺ HLA-A*0201⁺ καρκινική κυτταρική σειρά SKBR3.A2, όπως επιβεβαιώθηκε µε κυτταροµετρία ροής των IFN-γ/CD107a⁺ CD8⁺ κυττάρων. Τέλος, το πεπτίδιο HER-2(10₈₅) παρέτεινε σηµαντικά την βιωσιµότητα των HHD ποντικιών κατά την έγχυση σε αυτά ALC.A2.1.HER καρκινικών κυττάρων τόσο σε θεραπευτικό όσο και σε προφυλακτικό επίπεδο εµβολιασµού. Συµπερασµατικά, τα αποτελέσµατα από αυτήν τη µελέτη καταδεικνύουν την ιδιότητα του HER-2(10₈₅) ως ανοσογόνου επίτοπου, ικανού να επάγει ειδικές προς αυτό CD8 απαντήσεις in vitro και in vivo, θέτοντας τη βάση για την περαιτέρω εφαρµογή του πεπτιδίου αυτού ως πιθανό στόχο για την ανοσοθεραπεία του καρκίνου.