Μεταβολές ενδογενούς ουαμπαΐνης - διγοξίνης σε καταστάσεις stress

Abstract

In this study it was investigated if the adrenals produce the endogenous digitalis- like factor (EDLF) and whether this production is ACTH-dependent. Furthermore, it was examined whether and to what extend growth hormone may act as a stimulant of EDLF production. Finally partial purification of EDLF was performed. The main findings of this study are the following:1. EDLF existence and reactivity in plasma of peripheral circulation was confirmed. EDLF substances, extracted from normal subject’s plasma pool, resulted in an increase of intracellular sodium concentration and, on the contrary, in a decrease of intracellular potassium concentration as well as in a decrease in the number of ouabain binding sites (OBS). It was demonstrated that OBS decrease was probably due to occupation of binding sites by EDLF. All the above alterations imply inhibition of Na+,K+-ATPase.2. Methods for determination of EDLF concentration, are based on different properties of these substances. Furthermore, there is lack of specificity and various problems in these determinations; therefore, the use of as many methods as possible is required, so that higher accuracy for EDLF determination may be achieved.3. Results from 12 normal subjects and 11 patients with Addison's disease, showed that the patients with adrenal insufficiency are not able to produce EDLF. On the contrary, the normal subjects produce and secrete EDLF and this secretion is increased after adrenal stimulation by endogenous release (hypoglycemia test) or exogenous administration (Synacthen test) of ACTH. These results indicate that the adrenals are a main source of EDLF production. It appears that this production is ACTH- dependent.4. Cross-reactivity attributed to substances of the circulation that act as cross-reactants, was demonstrated to a certain extent in some of the methods used for the determination of EDLF concentration. Furthermore, HPLC results from normal subjects and patients with Addison's disease extracts, showed that in the EDLF-active fractions these substances could not be identified. Therefore, the measured EDLF concentration in these fractions may not be attributed to the cross-reactants examined. These results indicate clearly the existence and reactivity of EDLF substances in the plasma of peripheral circulation. 5. Results from 7 patients with GH deficiency, who were subjected to daily GH administration for 12 months, showed that GH had no effect on EDLF secretion. Tetracosactide administration was accompanied by an increase in the reactivity and also in the number of erythrocyte Na+,K+-ATPase units.6. During EDLF purification process from peripheral circulation plasma and partial identification -which was achieved in three steps-, it was found that only one fraction fulfilled all EDLF identification criteria. On the contrary, none of the HPLC fractions of the plasma pool extract of patients with Addison's disease after adrenal stimulation with exogenous ACTH administration fulfilled these criteria. In normal subjects EDLF reactivity was shown in more fractions, in fractions eluted later during HPLC purification process -indicating the existence of less polar substances- and this reactivity was significantly higher than in patients with Addison's disease before adrenal stimulation. Comparison of the retention time and wavelength of maximum absorbency characteristics, between substances identified in fractions with EDLF activity, and cardiac glycosides used as standard substances, suggests that EDLF activity could be attributed to a substance and active metabolites or to a mixture of substances, consisting of substances chemically related to digoxigenin, mono- and bis- digitoxoside digoxigenin and digoxin, but not to ouabain.

Στην εργασία αυτή διερευνήθηκε εάν τα επινεφρίδια παράγουν τον ενδογενή δακτυλιτιδόμορφο παράγοντα (EDLF) και κατά πόσο η παραγωγή αυτή είναι ACTH-εξαρτώμενη. Επιπλέον, εξετάστηκε εάν και κατά πόσο η αυξητική ορμόνη συμμετέχει στη διέγερση της έκκρισης EDLF. Τέλος, έγινε προσπάθεια για τη μερική ταυτοποίηση EDLF. Τα κυριότερα ευρήματα της εργασίας αυτής είναι τα ακόλουθα:1. Επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη και δραστικότητα ουσιών EDLF στο πλάσμα γενικής κυκλοφορίας. Ουσίες EDLF, που εκχυλίστηκαν από δεξαμενή πλάσματος φυσιολογικών ατόμων, προκάλεσαν αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης Νατρίου και αντίθετα μείωση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης Καλίου, καθώς και του αριθμού των θέσεων δέσμευσης ουαμπαΐνης (OBS). Αποδείχθηκε ότι η μείωση του OBS οφειλόταν στην κατάληψη θέσεων δέσμευσης ουαμπαΐνης από EDLF. Οι παραπάνω μεταβολές υποδηλώνουν αναστολή της Να+,Κ+-ΑΤΡάσης.2. Οι διαφορετικές μέθοδοι προσδιορισμού της συγκέντρωσης EDLF βασίζονται σε διαφορετικές ιδιότητες των ουσιών αυτών. Επιπλέον, η έλλειψη ειδικότητας αλλά και τα διάφορα προβλήματα που προκύπτουν κατά την εφαρμογή των μεθόδων αυτών, οδηγούν στο συμπέρασμα ότι για την ακριβέστερη ποσοτική εκτίμηση του EDLF απαιτείται η σύγχρονη εφαρμογή όσο το δυνατό περισσοτέρων μεθόδων.3. Τα αποτελέσματα από τα 12 φυσιολογικό άτομα και τους 11 ασθενείς με νόσο Addison που εξετάστηκαν, έδειξαν ότι οι ασθενείς με επινεφριδιακή ανεπάρκεια δεν είναι ικανοί να παράγουν EDLF. Αντίθετα, τα φυσιολογικά άτομα παράγουν και εκκρίνουν EDLF και η παραγωγή αυτή αυξάνεται μετά τη διέγερση των επινεφριδίων, με ενδογενή παραγωγή (δοκιμασία υπογλυκαιμίας) ή με εξωγενή χορήγηση (δοκιμασία Synacthen) ACTH. Τα απτελέσματα αυτά υποδεικνύουν τα επινεφρίδια ως κύρια πηγή παραγωγής EDLF. Είναι φανερό ότι η παραγωγή αυτή είναι ACTH- εξαρτώμενη.4. Μόνο σε κάποιες από τις μεθόδους προσδιορισμού της συγκέντρωσης EDLF -και σε μικρό βαθμό- βρέθηκε να συνεισφέρουν ουσίες που βρίσκονται στην κυκλοφορία και παρεμβαίνουν λόγω διασταυρούμενης αντίδρασης. Επιπλέον, τα αποτελέσματα από την HPLC έδειξαν ότι στα κλάσματα από τα εκχυλίσματα των φυσιολογικών ατόμων και των ασθενών με νόσο Addison, στα οποία παρατηρήθηκε δραστικότητα EDLF, δεν ανιχνεύτηκαν οι ουσίες αυτές. Είναι φανερό ότι στα κλάσματα αυτά, η μετρούμενη συγκέντρωση EDLF δεν οφείλεται σε διασταυρούμενη αντίδραση των ουσιών που εξετάστηκαν. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν σαφώς την ύπαρξη και δραστικότητα ουσιών EDLF στο πλάσμα γενικής κυκλοφορίας.5. Τα αποτελέσματα από 7 ασθενείς με έλλειψη G Η, οι οποίοι είχαν υποβληθεί για 12 μήνες σε καθημερινή χορήγηση της ορμόνης αυτής, έδειξαν ότι η G Η δε φαίνεται να συμμετέχει στη διέγερση της έκκρισης EDLF. Η χορήγηση συνθετικής κορτικοτροπίνης συνοδεύτηκε από την αύξηση της δραστικότητας, καθώς και του αριθμού των μορίων Na+,K+- ΑΤΡάσης στα ερυθροκύτταρα.6. Κατά την προσπάθεια καθαρισμού ουσιών EDLF από το πλάσμα γενικής κυκλοφορίας και της μερικής ταυτοποίησής τους, που επιτεύχθηκε σε τρία στάδια, διαπιστώθηκε ότι μόνο ένα κλάσμα πληρούσε όλα τα κριτήρια ταυτοποιήσης EDLF. Αντίθετα, κανένα από τα κλάσματα χρωματογράφησης του εκχυλίσματος από δεξαμενή πλάσματος ασθενών με νόσο Addison, μετά τη διέγερση των επινεφριδίων με εξωγενή χορήγηση ACTH, δεν πληρούσε τα κριτήρια αυτά. Στα φυσιολογικά άτομα, η δραστικότητα EDLF παρουσιάστηκε σε μεγαλύτερο αριθμό κλασμάτων, σε κλάσματα που εκλούονταν αργότερα κατά τη χρωματογράφηση -υποδεικνύοντας την ύπαρξη λιγότερο πολικών ουσιών- και που αθροιστικά ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από ότι στους ασθενείς με νόσο Addison πριν τη διέγερση των επινεφριδίων. Η σύγκριση του χρόνου ανάσχεσης και του μήκους κύματος μέγιστης απορρόφησης των ουσιών αυτών, που ανιχνεύτηκαν στα κλάσματα με δραστικότητα EDLF, με τα αντίστοιχα των προτύπων ουσιών, οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η δραστικότητα EDLF θα μπορούσε να αποδοθεί σε ουσία και στους δραστικούς μεταβολίτες της ή σε μίγμα ουσιών, που περιλαμβάνει ουσίες χημικά συγγενείς με τη διγοξιγενίνη, το μονογλυκοζίτη και διγλυκοζίτη της διγοξιγενίνης και τη διγοξίνη, όχι όμως την ουαμπαΐνη.