Εφαρμογή αισθητήρων βιοηλεκτρικής αναγνώρισης (BERA) νεότερης γενιάς στην ιολογία

Abstract

In the present PhD thesis the development of a cell-biosensor basic structure is described, which might detect, in minimal time and with satisfactory sensitivity, antigens and antibodies of viruses. The methodological approach is focused on the use of established laboratory techniques in biology, based on Bioelectric Recognition Assay (BERA), for the development of a simple operating system for the detection of viruses, in plants and humans. The use of electroporation is also described, for the preparation of “membrane-engineered” cells displaying a specific response to certain viruses. As representative example Vero fibroblasts were used, in the membrane of which, were inserted antibodies of CMV or TRV. The attachment of the homologous virus triggered the change of the cell membrane potential. All cells were immobilized in an alginate matrix. Regarding the first experimental part, the attachment of CMV on the cell-biosensor cells, bearing the homologous antibody and respectively in the studies with TRV, had as result the measurable change of the “membrane-engineered” cells’ potential. On the contrary the presence of non-homologous viruses such as CGMMV and PVY did not trigger any change. The above results were also confirmed with the use of fluorescence microscopy, where the presence of a homologous virus caused the change of Ca2+ concentration in the cytoplasm. The same process was applied to pure virus solutions in different dilutions: 0.0 ng ml-1 (control), 5.0, 7.0, 10.0, 13.0 and 20.0 ng ml-1 and in the case of TRV the results were encouraging regarding the possibility of quantitative determination of the virus. A short study was carried out as well, in order to evaluate the reaction of Vero cells, which were not “membrane engineered”, to the presence of TRV and CGMMV. The reaction was not specific, but it was obvious that the viruses’ presence triggered changes to the cell membrane potential.The development of a BERA biosensor as an application for the detection of hepatitis viruses was based on the same method. Two applications took place: The first application was related to the insertion, by electroporosis, of antibodies (anti-HBs, anti-HBe) on the membrane surface, for the detection of homologous antigens of HBV. The second application regarded the insertion of the antigen of the homologous virus (HBsAg) for the detection of the corresponding homologous antibody (anti-HBs). An alginate matrix was used as well for the immobilization of the “membrane engineered” cells. The method was applied on clinical samples; whereas hepatitis C virus (HCV) was used as the heterologous virus. The results showed that, in a very short time period (approximately 45 seconds) it is possible to detect virus elements, as well as to obtain information regarding the patient’s infectivity stage. The specificity of BERA biosensors based on “membrane engineered” cells depends from the specialisation of the antibodies or antigens, inserted on the surface of the cellular membrane. Consequently the described methodological approach incorporates similar disadvantages with the immunological methods. However it has other advantages such as sensitivity, short time response and reproducibility. Comparatively with the optical and electrochemical biosensors, the described in the present study system, has an additional advantage, which is the one step process. It should pointed out that the described method is a preliminary stage for the development of a biosensor system, based on “membrane-engineered” cells, incorporating a specialisation to the molecule, chemical compound or micro-organism that is going to be analyzed. A short study was carried out also in this case, in order to evaluate the reaction of Vero cells, which were not “engineered”, to the presence of HBsAg and HCV. The reaction was not specific, but it was concluded that the cell membrane potential values were following a linear pattern, in both cases.We examined the possibility to develop a biosensor for the detection of plant viruses, which would be more stable. For the construction of the sensor an automated system was developed and the biosensor itself was produced it the wells of an ELISA plate. The method was applied for TRV, CMV and PVY. The samples were purified virus or infected plant tissues. Three different concentrations were used 1, 10 and 100ngml-1. The results were very encouraging and at the first stage it was made possible to detect a virus in single and in mixed infections and to define the lower detection limit, which was similar with ELISA method’s respective limit (1ngml-1). It was shown also the possibility to quantify a virus in a sample. In order to study the performance of BERA sensors, a comparative analysis took place and an amperometric sensor was developed, specialized in the detection of PVY. The amperometric sensor succeeded in differentiating positive from non-positive samples (nonhomologous viruses or negative samples), but the detection limit was higher compared to the respective limit of BERA sensors. Consequently this sensor is not suitable for screening of plant tissue samples with low virus concentration, contrary to the BERA sensors developed in the present thesis

Στην παρούσα διατριβή περιγράφεται η ανάπτυξη μια βασικής δομής κυτταρικών βιοαισθητήρων, οι οποίοι θα μπορούν να ανιχνεύουν σε ελάχιστο χρόνο και με ικανοποιητική ευαισθησία, αντιγόνα και αντισώματα ιών. Η μεθοδολογική προσέγγιση εστιάζεται στην χρήση γνωστών εργαστηριακών τεχνικών στη βιολογία, βασισμένων στη Βιοηλεκτρική Δοκιμή Αναγνώρισης (Bioelectric Recognition Assay – BERA) για την επίτευξη ενός απλού στη λειτουργία συστήματος ανίχνευσης ιών, σε φυτικούς και ανθρώπινους οργανισμούς. Επίσης, περιγράφεται η χρήση της τεχνικής της ηλεκτροπόρωσης για την δημιουργία εξειδικευμένων «τροποποιημένων» κυττάρων στην παρουσία συγκεκριμένων ιών. Σαν αντιπροσωπευτικό παράδειγμα χρησιμοποιήθηκαν ινοβλάστες Vero, στην μεμβράνη των οποίων με τη χρήση της εν λόγω τεχνικής, εισήχθησαν αντισώματα των ιών CMV ή TRV ως προς την ανίχνευση των αντίστοιχων ιών που προσβάλουν φυτικούς οργανισμούς και αντισώματα και αντιγόνα του HBV. Σε σχέση με το πρώτο τμήμα του πειραματικού μέρους, η πρόσδεση του CMV στα κύτταρα του αισθητήρα και, σε δεύτερο πείραμα, του TRV, είχε σαν αποτέλεσμα την πρόκληση συγκεκριμένης και μετρήσιμης μεταβολής στο δυναμικό της μεμβράνης των «τροποποιημένων» κυττάρων του βιοαισθητήρα. Αντίθετα η παρουσία μη ομόλογων ιών όπως του CGMMV και του PVY δεν προκάλεσε καμία μεταβολή στο δυναμικό της μεμβράνης των κυττάρων. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και με τη χρήση μικροσκοπίας φθορισμού, όπου η παρουσία ομόλογου ιού ως προς τα αντισώματα που έφεραν τα «τροποποιημένα» κύτταρα, είχε σαν αποτέλεσμα τη μεταβολή της συγκέντρωσης των ιόντων ασβεστίου του κυτταροπλάσματος. Επιπρόσθετα η εφαρμογή της ανωτέρω μεθόδου σε δείγματα καθαρού ιού σε διαφορετικές συγκεντρώσεις: 0.0 ng ml-1 (control), 5.0, 7.0, 10.0, 13.0 και 20.0 ng ml-1, στην περίπτωση του TRV μας έδωσε ενθαρρυντικά αποτελέσματα ως προς τη δυνατότητα ποσοτικού προσδιορισμού του ιού. Μελετήθηκε επίσης η επίδραση των TRV και CGMMV στο δυναμικό των ινοβλαστών Vero, καθώς και η πιθανότητα χρήσης μητροποποιημένων κυττάρων στην ανίχνευση των εν λόγω ιών. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η αντίδραση δεν είναι μεν εξειδικευμένη όμως είναι εμφανής η επίδραση των δύο ιών στο μεμβρανικό δυναμικό. Η ανάπτυξη ενός βιοαισθητήρα BERA ως εφαρμογή στην ανίχνευση της παρουσίας ηπατικών ιών βασίστηκε στις ίδιες τεχνικές, προσαρμοσμένες στις ιδιαιτερότητες των εν λόγω ιών. Η τροποποίηση των κυττάρων περιελάμβανε την εισαγωγή, με τη χρήση της τεχνικής της ηλεκτροπόρωσης, στην μεμβράνη των κυττάρων Vero του βιοαισθητήρα, αντισωμάτων (anti-HBs, anti-HBe) σαν πρώτη εφαρμογή για την ανίχνευση των αντίστοιχων αντιγόνων του HBV και ως δεύτερη εφαρμογή την εισαγωγή αντιγόνου του ιδίου ιού (HBsAg) για την ανίχνευση του αντίστοιχου αντισώματος. Η εφαρμογή έλαβε χώρα σε κλινικά δείγματα ορού αίματος ασθενών, ενώ ως ετερόλογος ιός χρησιμοποιήθηκε ο ιός C της ηπατίτιδας (HCV). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε πολύ μικρό χρόνο μόλις 45 δευτερόλεπτα είναι δυνατή η ανίχνευση των μολυσματικών στοιχείων του ιού, αλλά και η εξαγωγή συμπερασμάτων για το στάδιο της μολυσματικότητας που βρίσκεται ο ασθενής. Η εκλεκτικότητα των βιοαισθητήρων BERA βασισμένων σε «τροποποιημένα» κύτταρα εξαρτάται πάντα από την εξειδίκευση των αντισωμάτων ή των αντιγόνων που έχουν εισαχθεί στην επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης. Συνεπώς η περιγραφείσα μεθοδολογική προσέγγιση ενσωματώνει πολλά από τα μειονεκτήματα που εμφανίζουν και οι ορολογικές μέθοδοι. Παρόλα αυτά όμως πλεονεκτεί σημαντικά ως προς την ευαισθησία, την ταχύτητα απόκρισης και την επαναληψιμότητα. Συγκριτικά με τους οπτικούς και ηλεκτροχημικούς αισθητήρες, το σύστημα που περιγράφεται στην παρούσα εργασία έχει τα επιπλέον πλεονεκτήματα της απλούστερης χρήσης και της ολοκλήρωσης της διαδικασίας ανίχνευσης σε ένα βήμα. Θα πρέπει όμως να επισημανθεί ότι αποτελεί ένα προκαταρκτικό στάδιο για την ανάπτυξη ενός ολοκληρωμένου συστήματος βιοαισθητήρα, το οποίο θα βασίζεται σε κύτταρα των οποίων η μεμβράνη έχει τροποποιηθεί κατάλληλαπροσδίδοντας τους εξειδίκευση ως προς το μόριο, χημική ένωση ή μικροοργανισμό που πρόκειται να αναλυθεί. Όπως και στην περίπτωση των TRV και CGMMV μελετήθηκε και η επίδραση της παρουσίας του HBsAg και του HCV στο δυναμικό της μεμβράνης των κυττάρων Vero για μια συγκεκριμένη χρονική στιγμή και διαπιστώθηκε, ότι ναι μεν δεν μπορούν απλά κύτταρα να δώσουν εξειδικευμένη αντίδραση, οι τιμές όμως του δυναμικού για τη συγκεκριμένη χρονική στιγμή μεταβάλλονται γραμμικά. Εξετάσθηκε εκ νέου η δυνατότητα ανάπτυξης βιοαισθητήρα ανίχνευσης ιών οι οποίοι προσβάλουν φυτικούς οργανισμούς, βασικά χαρακτηριστικά του οποίου ήταν η χρήση αυτοματοποιημένου συστήματος επαφής των ηλεκτροδίων με τους βιοαισθητήρες. ...