Ο μηχανισμός της μεθυλίωσης ρυθμιστικών γονιδίων εμβρυϊκής ανάπτυξης ως αιτιολογικός παράγοντας αυτόματων εκτρώσεων και ενδομήτριας υπολειπόμενης ανάπτυξης

Abstract

Introduction Intrauterine Growth Restriction (IUGR) is a pathological reduction in an expected pattern of fetal growth that leads to attenuation of fetal growth potential due to an insult that has occurred in utero. The causes of IUGR are not well understood. Several clinical and pathologic etiological classification systems have been proposed. All of them highlight the 3 compartments of pregnancy, i.e. fetal, maternal and placental. But none of these classification systems has led to the elucidation of the basic mechanisms of SGA/IUGR. A variety of studies demonstrated that IUGR is often attributed to a broad and vaguely-defined condition called “placental insufficiency”. Νo molecular diagnostic markers have been indentified to date, to detect fetuses that are at increased risk of developing IUGR later in pregnancy. Imprinted genes are recognized to be involved in regulating definite placental growth, development and function and therefore considered suitable candidates for a role in IUGR. Genomic imprinting is the preferential silencing of one copy of an autosomal gene while the other copy is expressed. This parent-of-origin-specific expression is regulated by epigenetic modifications, such as DNA methylation. A large proportion of imprinted genes is expressed in the placenta and affects the growth, morphology and nutrient transfer capacity of the placental exchange barrier. Imprinted genes that are paternally expressed (maternally imprinted) promote growth of the fetus, whilst maternally expressed (paternally imprinted) genes act as growth suppressor to assure appropriate allocation of limited maternal resources to each offspring. IGF2 and H19, represent two oppositely expressed genes located adjacent to each other at 11p15.5, that share the same transcription regulatory epigenetic mechanisms and have an important role in feto-placental development. Research on IGF2/H19 imprinting has revealed complicated regulatory mechanisms including multiple enhancers, silencers, and boundary elements. Many studies have implicated specific regions of differential DNA methylation as critical for correct allelic expression of these imprinted genes. In most human tissues the imprinting of IGF2/H19 depends upon a differentially methylated region DMR which is located upstream of H19 promoters. This region functions as a methylation-sensitive insulator that binds to a CCCTC factor (CTCF) on the unmethylated maternal allele which prevents the interaction of IGF2 with enhancers located downstream of H19, partitioning the two alleles into transcriptionally ‘silent’ and ‘active’. Maternal IGF2 is silenced because CTCF preferentially binds to the unmethylated maternal allele, while methylation on the paternal allele prevents binding, thus allowing enhancers asses IGF2 promoter and expression of the paternal IGF2. Two other differentially methylated regions exist. H19 promoter and IGF2 DMR, are also located in this area and are paternally methylated. The implication of IGF2 and H19 with congenital growth syndromes motivated us to examine the possible relation of IGF2/H19 expression, imprinting and methylation patterns in placentas deriving from pregnancies complicated with fetal growth restriction. Aberrant DNA methylation which can modify imprinted genes expression may provide an attractive mechanism linking environmental causes to placental insufficiency and subsequently development of fetal growth restriction. With the aim to clarify the role of the imprinted IGF2 and H19 in the pathogenesis of IUGR, we sought to determine whether altered IGF2 or H19 expression might correlate with relaxed imprinting in IUGR placentas. We also examined the epigenetic profiles of the IGF2/H19 domain in these tissues to determine if deregulated methylation status correlated with IGF2/H19 expression and potential imprinting deregulation. We postulated that altered epigenetic mechanisms may affect IGF2/H19 imprinting and deregulate their expression leading to IUGR. Materials and Methods Placentas were obtained after vaginal deliveries or caesarean sections from 31 women with singleton pregnancies that where complicated with IUGR and 17 normal pregnancies. Estimated Fetal Weight (EFW) was below the 5th percecentile and all pregnancies also demonstrated sonographic features of IUGR. Control placentas were obtained from pregnancies with appropriate-for-gestational-age (AGA) term fetuses with, birth weight (BW)>10th percentile and no other pregnancy complications. Genomic DNA was extracted from IUGR and normal placentas using the phenol/chloroform protocol, as previously described. Tissue specimens were homogenized in TRIzol® reagent and total RNA was extracted. RNA concentration was calculated with an UV spectrophotometer. Reverse transcription reactions for the preparation were performed. The mRNA expression of IGF2 and H19 was measured using a real-time RT-PCR assay with SYBR® Green I. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as an internal control to normalize IGF2 and H19 mRNA expression levels...

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ενδομήτρια υπολειπόμενη ανάπτυξη (ΕΥΑ) (intrauterine growth restriction IUGR) περιγράφει μία κατάσταση κατά την οποία το έμβρυο δεν μπορεί να αναπτυχθεί όσο του υπαγορεύει η γενετική του προδιάθεση. Τα νεογνά που γεννιούνται με ΕΥΑ είναι μικρότερα για τη δεδομένη ηλικία κύησης (μικρά για την ηλικία κύησης, small for gestational age SGA), και το βάρος τους είναι κάτω από την 10η ή 5η ή 3η εκατοστιαία θέση για την ηλικία κύησης, σύμφωνα με διαφορετικούς ορισμούς. Είναι πολύ σημαντικό να είμαστε σε θέση να διαγνώσουμε τα νεογνά που είναι μικρά για την ηλικία κύησης επειδή είχαν υπολειπόμενη ανάπτυξη κατά τη διάρκεια της ενδομήτριας ζωής τους, σε σχέση με αυτά που είναι «προγραμματισμένα» για να γεννηθούν μικρά. Τα νεογνά της πρώτης κατηγορίας, εμφανίζουν βραχυπρόθεσμες και μακροπρόθεσμες επιπτώσεις στην ανάπτυξη και υγεία τους γιατί ουσιαστικά κάποιος βλαπτικός παράγοντας επέδρασε στην ομαλή αύξηση τους κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ζωής τους με αποτέλεσμα να μην αναπτυχθούν όσο θα μπορούσαν με βάση τη γενετική τους προδιάθεση. Οι αιτιολογικοί παράγοντες που έχουν συσχετιστεί με την παθοφυσιολογία της ΕΥΑ έχουν παραδοσιακά χωριστεί σε 3 κατηγορίες: μητρικοί, εμβρυικοί και μητροπλακουντιακοί παράγοντες. Η πλακουντιακή ανεπάρκεια όμως αφορά την πλειοψηφία των περιπτώσεων ΕΥΑ. Η συνεχιζόμενη έρευνα για την ανεύρεση των παθογενετικών μηχανισμών της ΕΥΑ έχει συσχετίσει διαφορετικά γενετικά αίτια με την εμφάνιση της παθολογικής αυτής οντότητας. Παρόλα αυτά δεν έχει βρεθεί κάποιος παράγοντας ο οποίος μπορεί να προβλέψει την εμφάνιση ΕΥΑ από τα αρχικά στάδια της κύησης, ή να μπορεί να εξηγήσει την παθοφυσιολογία της νόσου. Οι έρευνες σε μοριακό επίπεδο θα μπορούσαν να βοηθήσουν στη διαλεύκανση των διεργασιών που αφορούν την ΕΥΑ, η οποία είναι ξεκάθαρο πλέον ότι δεν αποτελεί μία μεμονωμένη νόσο, αλλά ένα σύμπτωμα πολλών διαφορετικών επιπλοκών της κύησης. Τα γονίδια αποτύπωσης αποτελούν μία κατηγορία γονιδίων που σχετίζονται με την αύξηση και τη λειτουργία του πλακούντα, και κατά συνέπεια αποτελούν ιδανικούς υποψηφίους για τη μελέτη γενετικών μηχανισμών που σχετίζονται με διαταραχές στην πλακουντιακή λειτουργία που συνεπάγονται καθυστέρηση της ανάπτυξης του εμβρύου. Η αποτύπωση αποτελεί ένα μοριακό μηχανισμό κατά τον οποίο μόνο το ένα αλληλόμορφο από ένα ζεύγος γονιδίων εκφράζεται, και εξαρτάται από την προέλευση του χρωμοσώματος του (μητρική ή πατρική) το κατά πόσο θα εκφραστεί ή όχι. Αυτή η ελεγχόμενη έκφραση, ρυθμίζεται από επιγενετικούς μηχανισμούς όπως η μεθυλίωση του DNA. Η μεθυλίωση της κυτοσίνης μπλοκάρει τον μηχανισμό μεταγραφής ενός γονιδίου. Η μεθυλίωση στους εκκινητές των γονιδίων έχει σαν αποτέλεσμα την μη αναγνώριση τους από τους παράγοντες μεταγραφής και την RNA πολυμεράση, αφού οι μεθυλιωμένες κυτοσίνες προτιμούν να συνδέονται με μία πρωτείνη η οποία ονομάζεται μεθυλ- κυτοσίνη συνδετική πρωτείνη ή MeCP. Όταν η περιοχή ενός εκκινητή αναγνωριστεί από έναν παράγοντα μεταγραφής ως μεθυλιωμένη, τότε η μεταγραφή θα ανασταλεί. Πολλά γονίδια αποτύπωσης εκφράζονται σε σημαντικό βαθμό στον πλακούντα και επηρεάζουν τη λειτουργία και τη μορφολογία του. Τα πατρικής προέλευσης εκφραζόμενα γονίδια ευνοούν την ανάπτυξη του εμβρύου, ενώ αντίθετα τα μητρικής προέλευσης εκφραζόμενα γονίδια «φρενάρουν» την ανεξέλεγκτη παροχή συστατικών προς το έμβρυο με στόχο την εξοικονόμηση πόρων προς όφελος της μητέρας και των επόμενων κυήσεων. Τα γονίδια IGF2 και Η19 αποτελούν δύο γονίδια αποτύπωσης που μοιράζονται κοινούς μεταγραφικούς μηχανισμούς αλλά με αντίθετο τρόπο και παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του εμβρύου. Το γονίδιο IGF2 εκφράζεται από το πατρικό αλληλόμορφο και ευνοεί την ανάπτυξη του εμβρύου ενώ το μητρικό αλληλόμορφο δεν μεταγράφεται. Αντίθετα το μητρικό αλληλόμορφο του γονιδίου Η19 είναι εκείνο που εκφράζεται και αν και δεν κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη, θεωρείται πως έχει ιδιότητες που καταστέλλουν την ανάπτυξη. Ερευνητικές μελέτες έχουν καταδείξει συγκεκριμένες περιοχές των δύο γονιδίων που έχουν διαφορετικό προφίλ μεθυλίωσης σε κάθε αλληλόμορφο με αποτέλεσμα να ελέγχουν την έκφραση τους. Πιο συγκεκριμένα, μία περιοχή με διαφορετικό προφίλ μεθυλίωσης (Differentially Methylated Region DMR) που εδράζεται μεταξύ των δύο γονιδίων, είναι υπεύθυνη για την αντίθετη αποτύπωση των δύο γονιδίων. Αν η περιοχή αυτή είναι υπομεθυλιωμένη, τότε επιτρέπεται η σύνδεση της με τον παράγοντα CTC Factor (CTCF) ο οποίος εμποδίζει την δράση διεγερτών στους εκκινητές του IGF2 με αποτέλεσμα το IGF2 να μη μεταγράφεται και να μεταγράφεται το Η19. Αντίθετα αν η συγκεκριμένη περιοχή είναι μεθυλιωμένη η πρόσδεση του παράγοντα CTCF δεν επιτρέπεται με αποτέλεσμα οι διεγέρτες να επιδρούν στους εκκινητές του IGF2 και να μεταγράφεται το IGF2 και να μην εκφράζεται το Η19. Συνεπώς υπό φυσιολογικές συνθήκες το μητρικό αλληλόμορφο είναι υπομεθυλιωμένο και το IGF2 δεν μεταγράφεται σε αυτό ενώ μεταγράφεται το Η19...