Λειτουργική μελέτη μεταλλοπρωτεασών εξωκυττάριας στοιβάδας στο φορέα ελονοσίας Anopheles gambiae: διερεύνηση του ρόλου τους στις αλληλεπιδράσεις του κουνουπιού με το παράσιτο της ελονοσίας

Abstract

Midgut epithelial responses triggered by Plasmodium ookinete invasion in the vector Anopheles gambiae is a matter of intense research, due to their direct or indirect involvement in parasite survival. For this reason we undertook the effort to study mosquito metalloproteases of the extracellular matrix (ECM), which are the main enzymes involved in epithelial reorganization in several organisms. Taking advantage of gene predictions of Anopheles database, as well as, of phylogenetic relationships, we identified representative members of all three major families of ECM metallo-proteinases, ADAMs, ADAMTSs and MMPs. Transcriptional profiling indicated putative implications of ADAMs and ADAMTSs in developmental processes, however, an additional involvement of those proteases in vector-parasite interactions cannot be excluded. Our study was mainly focused on MMP-1, a representative member of MMP family of metalloproteases. Reverse genetics, cell biology and transcriptional profiling, as well as, the use of established Anopheles gambiae hemocyte-like cell lines, revealed not only involvement of AgMMP1 in the processes of midgut epithelial reconstitution after parasite invasion, as expected, but in addition a protective role of the AgMMP1 protease in the survival of the parasite during the oocyst stage. Our data indicate that these two roles are probably conferred by different MMP1 isoforms; a transmembrane and a secreted form, expressed in the mosquito midgut epithelium and hemocytes respectively.

Το πέρασμα του ωοκινέτη από το μεσεντερικό επιθήλιο του κουνουπιού προκαλεί μια σειρά αποκρίσεων από το τελευταίο που επηρεάζουν την βιωσιμότητα του παρασιτικού πληθυσμού είτε άμεσα, είτε έμμεσα μέσω ανοσοποιητικών μηχανισμών. Για τους παραπάνω λόγους θελήσαμε να χαρακτηρίσουμε γονίδια του Ανωφελούς που κωδικοποιούν μεταλλοπρωτεάσες της εξωκυττάριας μήτρας, αφού αυτές θεωρούνται σε άλλους οργανισμούς ότι παίζουν βασικό ρόλο στην αναδιάταξη των επιθηλίων. Η αναζήτηση στη δημοσιευμένη αλληλουχία του γονιδιώματος του κουνουπιού, και η μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων με ομόλογα γονίδια από άλλους οργανισμούς μας οδήγησαν στην ταυτοποίηση πρωτεασών της εξωκυττάριας μήτρας που ανήκουν σε τρεις διαφορετικές οικογένειες, τις ADAMs, ADAMTSs και τις MMPs. Το μεταγραφικό πρότυπο των ADAMs και ADAMTSs έδειξε ρύθμιση της έκφρασης τους σε στάδια διαφοροποίησης του εντόμου, γεγονός που συμφωνεί και με δεδομένα από άλλους οργανισμούς για πιθανή εμπλοκή τους σε αναπτυξιακές διεργασίες. Η μελέτη μας επικεντρώθηκε κυρίως στον χαρακτηρισμό του γονιδίου MMP-1, που ανήκει στην οικογένεια των MMP μεταλλοπρωτεασών, από το οποίο βρήκαμε να εκφράζονται, μετά από εναλλακτικό μάτισμα, δυο ισομορφές της MMP1 πρωτεΐνης, μια επιθηλιακή διαμεμβρανική και μια εκκρινόμενη την οποία εντοπίσαμε στα περιφερειακά αιμοκύτταρα του ενήλικου ατόμου. Το μεταγραφικό πρότυπο του γονιδίου, σε συνδυασμό με πειράματα αντίστροφης γενετικής και κυτταρικής βιολογίας ανέδειξαν ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε πολλαπλά επίπεδα (μεταγραφικό, μετα-μεταγραφικό, μετα-μεταφραστικό) και πιθανή εμπλοκή της MMP1 πρωτεάσης στην διαδικασία επούλωσης του επιθηλίου μετά από το πέρασμα του ωοκινέτη μέσα από αυτό. Επιπλέον όμως υπέδειξαν ότι το(α) προϊόν(τα) του ΜΜΡ1 γονιδίου λειτουργούν προστατευτικά για την επιβίωση του παρασίτου κατά την διάρκεια της πρώϊμης ανάπτυξης της ωοκύστης. Μάλιστα τα ευρήματα μας μας οδηγούν στην υπόθεση ότι οι δύο διακριτοί βιολογικοί ρόλοι της πρωτεάσης, εμπλοκή στην αναδιάταξη του μεσεντέρου του κουνουπιού και προστασία της πρώϊμης ωοκύστης του παρασίτου, μπορεί να εκτελούνται από την διαμεμβρανική και την εκκρινόμενη ισομορφή αντίστοιχα.