Εφαρμογή νέων μεθόδων τυποποίησης Gram-θετικών μικροοργανισμών ως μέτρο διερεύνησης και ελέγχου επιδημιών

Abstract

The purpose of this study was the molecular typing of representative strains of Gram-positive bacteria isolated from clinical specimens from different regions of our country, in order to map the predominant clones per microorganism in Greece and compare them with global epidemic clones. The characterization of pathogenic strains of microorganisms plays a central role in the epidemiology of nosocomial infections by creating the necessary information for the identification, detection and intervention during hospital outbreaks. For this purpose 575 strains Gram-positive bacteria were isolated from clinical patient samples (blood, pus, urine, feces, vaginal swabs) from seven hospitals of our country in the period 2008-2011. Specifically 186 strains of VRE Enterococcus faecium, 30 strains Linezolid Resistant Enterococcus faecalis, 126 strains Staphylococcus aureus (88 MRSA, 38 MSSA), 35 strains Linezolid Resistant Staphylococcus epidermidis, 80 strains of Streptococcus pyogenes and 118 strains Streptococcus agalactiae were studied. The characterization of isolates was performed with the method of MLST (Multi Locus Sequence Typing). The method generates approximately 400-600 bp of nucleotide sequence for internal fragments of seven housekeeping loci for each isolate.These are constant internal genes of chromosome associated with basic metabolic functions of the bacterial cell. Initially clinical strains were subjected on the phenotypic control: in culture, in biochemical tests for the identification of the strains to the genus and species level and antibiotic susceptibility testing (VITEK-2, E-test). The isolation of DNA was performed by extraction with the automated system Magtration. The amplification of all gene fragments was carried out using the Polymerase Chain Reaction (PCR). This was followed by electrophoresis of the amplified genes on agarose gel and purification of DNA. Sequence analysis of each gene fragment was performed by the modified Sanger method and determined using specialized bioinformatics programs (Mega 5.0, ClustalW). The isolates were classified into STs types in combination with databases of MLST. The main clones per bacterium which were identified are: in E. faecium ST412, ST17, ST203, in E. faecalis ST28, ST6, ST9, in S. aureus ST80, ST225, ST239, in S. epidermidis ST22, ST2, ST35, in S. pyogenes ST36, ST28, ST101 and in S. agalactiae ST1, ST22 and ST17. The study of the genetic relatedness of clones made through the implementation of an algorithm eBURST, which enables the classification of clones of bacteria in clonal complexes with similar genetic traits and the comparison with global epidemic clones. The comparison of our clones with global epidemic clones showed that pathogenic clones worldwide epidemic are circulating in Greek hospitals and it is necessary to be taken stringent measures to prevent and reduce nosocomial infections.

Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μοριακή τυποποίηση αντιπροσωπευτικών στελεχών Gram-θετικών βακτηρίων, που απομονώθηκαν από κλινικά δείγματα ασθενών, από διαφορετικές περιοχές της χώρας μας, με στόχο να χαρτογραφηθούν οι επικρατέστεροι κλώνοι ανά μικροοργανισμό στην Ελλάδα και να συγκριθούν με παγκόσμιους επιδημικούς κλώνους. Ο χαρακτηρισμός των παθογόνων στελεχών των μικροοργανισμών διαδραματίζει έναν κεντρικό ρόλο στην επιδημιολογία των ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων δημιουργώντας τις απαραίτητες πληροφορίες για τον προσδιορισμό, τον εντοπισμό και την παρέμβαση κατά την διάρκεια νοσοκομειακών επιδημικών εξάρσεων. Για τον σκοπό αυτό απομονώθηκαν από κλινικά δείγματα ασθενών (αίμα, πύον, ούρα, κόπρανα, κολπικά επιχρίσματα), 575 στελέχη Gram-θετικών βακτηρίων, από επτά μεγάλα νοσοκομεία της χώρας μας κατά την χρονική περίοδο 2008-2011. Συγκεκριμένα μελετήθηκαν 186 στελέχη VRE Enterococcus faecium, 30 στελέχη Linezolid Resistant Enterococcus faecalis, 126 στελέχη Staphylococcus aureus (88 MRSA, 38 MSSA), 35 στελέχη Linezolid Resistant Staphylococcus epidermidis, 80 στελέχη Streptococcus pyogenes και 118 στελέχη Streptococcus agalactiae. Ο χαρακτηρισμός όλων των στελεχών πραγματοποιήθηκε με την μοριακή μέθοδο της MLST. Η MLST (Multi Locus Sequence Typing) ή Πολυτοπικός Προσδιορισμός Αλληλουχίας αναπαράγει νουκλεοτιδικές αλληλουχίες εσωτερικών γονιδιακών θραυσμάτων των 400-600 (bp) από τυποποιημένα σχήματα των επτά διατηρημένων γονιδίων, διαφορετικών ανά βακτηριακό είδος. Πρόκειται για σταθερά εσωτερικά γονίδια του χρωμοσώματος που σχετίζονται με βασικές μεταβολικές λειτουργίες του βακτηριακού κυττάρου. Αρχικά τα βακτηριακά στελέχη υποβλήθηκαν, στα πλαίσια του φαινοτυπικού ελέγχου σε καλλιέργεια, σε βιοχημικές δοκιμασίες για την ταυτοποίηση τους σε επίπεδο γένους και είδους και σε τεστ ευαισθησίας στα αντιβιοτικά (VITEK-2, E-test). Η απομόνωση του DNA τους πραγματοποιήθηκε μέσω της εκχύλισης τους με το σύστημα Magtration. Η ενίσχυση των επτά γονιδιακών θραυσμάτων κάθε στελέχους πραγματοποιήθηκε με την μέθοδο της Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (PCR). Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των ενισχυμένων γονιδίων σε πήκτωμα αγαρόζης και καθαρισμός του DNA. Η ανάλυση αλληλουχίας τους έγινε με την τροποποιημένη κατά Sanger μέθοδο και προσδιορίστηκε με την χρήση εξειδικευμένων προγραμμάτων βιοπληροφορικής (Mega 5.0, ClustalW), που σε συνδυασμό με τις βάσεις δεδομένων της MLST, τα στελέχη των βακτηρίων ταξινομήθηκαν σε STs τύπους. Οι κυριότεροι κλώνοι που εντοπίστηκαν ανά βακτήριο είναι: στον E. faecium οι ST412, ST17, ST203, στον E. faecalis οι ST28, ST6, ST9, στον S. aureus οι ST80, ST225, ST239, στον S. epidermidis οι ST22, ST2, ST35, στον S. pyogenes οι ST36, ST28, ST101 και στον S. agalactiae οι ST1, ST22 και ST17. Η μελέτη της γενετικής συγγένειας των βακτηριακών στελεχών πραγματοποιήθηκε, με εφαρμογή του αλγορίθμου eBURST που δίνει την δυνατότητα της ταξινόμησης των κλώνων σε συμπλέγματα με παρόμοια γενετικά χαρακτηριστικά και την σύγκριση τους με παγκόσμιους επιδημικούς κλώνους. Η έρευνα έδειξε ότι στα ελληνικά νοσοκομεία κυκλοφορούν παθογόνοι επιδημικοί κλώνοι παγκόσμιας εμβέλειας και είναι αναγκαίο να παρθούν αυστηρότερα μέτρα πρόληψης και μείωσης των ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων.