Διερεύνηση του ρόλου του HIF-2α στην κυτταρική ομοιοστασία

Abstract

Τhe hypoxia inducible transcription factors, HIF-1α and HIF-2α, play central roles in the cellular response to hypoxia. In the present thesis, the molecular mechanisms of HIF-2α expression and regulation were investigated.First, the mechanism of HIF-2α induction under hypoxia or in the presence of cobalt was examined in hepatoma cells and it was found that hypoxia induces HIF-2α protein expression by ROS- and PI3K-dependent mechanism, while cobalt induces HIF-2α protein expression by a ROS-, PI3K- and ERK1/2-dependent mechanism. However, cobalt, unlike hypoxia, does not induce the transcriptional activity of HIF-2. Specifically, it was shown for the first time that cobalt cannot activate the HIF-2α dependent SOD2 promoter, EPO mRNA synthesis or EPO secretion. This negative effect of cobalt was cell type specific and was not observed for HIF-1.Second, mechanisms of HIF-2α post-translational regulation were studied and it was found that they involve kinases CK1 and ERK1/2. CK1 affects negatively the transcriptional activity of HIF-2, without affecting HIF-2α protein expression levels, possibly by phosphorylating Ser 249 of HIF-2α in hepatoma cells. On the other hand, ERK1/2 enhanced HIF-2 transcriptional activity, also without affecting HIF-2α protein expression levels but by inhibiting HIF-2α nuclear export and stimulating its nuclear accumulation in hepatoma cells. Deletion studies suggest the HIF-2α amino acid region 366-542 contains a nuclear export signal which is controlled by ERK1/2-dependent phosphorylation.The third aim of the thesis was the investigation of the effect of proteasome inhibitor bortezomib on induction of HIF-1α in prostate cancer cells and HIF-2α in hepatoma cells. Under hypoxia, bortezomib inhibited HIF-1α protein synthesis by impairing the PI3K/Akt/mTOR pathway and decreased HIF-1α nuclear accumulation and transcriptional activity by interfering with the ERK1/2 pathway in PCa cells. The effect of bortezomib on HIF-2α expression and activity in hepatoma cells was identical. Bortezomib does not affect the hypoxic induction of HIF-2α, but represses its transcriptional activity in hepatoma cells.These results contribute to the elucidation of the mechanisms of HIF-2α induction or activation and to understanding the differences in the regulation of HIF-1α and HIF-2α by hypoxia and cobalt that may reflect their discrete role in cellular homeostasis.

Οι μεταγραφικοί παράγοντες που επάγονται από την υποξία, HIF-1α και HIF-2α, διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην απόκριση των κυττάρων στην υποξία. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν οι μηχανισμοί ρύθμισης της έκφρασης και ενεργοποίησης του ΗΙF-2α και συγκρίθηκαν με εκείνους του HIF-1α.Αρχικά, διερευνήθηκε ο μηχανισμός επαγωγής του HIF-2α σε κύτταρα ηπατοκαρκινώματος στην υποξία ή παρουσία κοβαλτίου και βρέθηκε ότι η υποξία επάγει τον HIF-2α με συμμετοχή των μονοπατιών PI3K και ROS, ενώ το κοβάλτιο χρησιμοποιεί επιπλέον το μονοπάτι των ERK. Παρόλο που ο HIF-2α εντοπίζεται αποκλειστικά στον πυρήνα παρουσία κοβαλτίου, δεν είναι μεταγραφικά ενεργός. Για πρώτη φορά βρέθηκε ότι το κοβάλτιο, σε αντίθεση με την υποξία, δεν επάγει ειδικούς μεταγραφικούς στόχους του HIF-2 σε κύτταρα ηπατοκαρκινώματος, όπως την SOD2 και την EPO. Ωστόσο, το κοβάλτιο επάγει την μεταγραφική ενεργότητα του HIF-2 σε μη ηπατικά καρκινικά κύτταρα και επάγει τη δράση του HIF-1 σε όλες τις κυτταρικές σειρές.Στη συνέχεια, διερευνήθηκε ο μηχανισμός μετα-μεταφραστικής ρύθμισης του HIF-2α και διαπιστώθηκε ότι εμπλέκονται η κινάση της καζεΐνης 1 (CK1) και οι ERK1/2. Βρέθηκε ότι η CK1 επηρεάζει αρνητικά την μεταγραφική ενεργότητα του HIF-2, χωρίς να επηρεάζει την έκφραση του, πιθανόν μέσω φωσφορυλίωσης του στη Ser249, σε κύτταρα ηπατοκαρκινώματος. Όσον αφορά τις ERK1/2, διαπιστώθηκε ότι οι ERK1/2 ενισχύουν τη μεταγραφική ενεργότητα του HIF-2, χωρίς να επηρεάζουν την έκφραση του, αλλά αναστέλλοντας το μηχανισμό πυρηνικής εξαγωγής του HIF-2α. Επίσης, βρέθηκε για πρώτη φορά ότι η αμινοξική περιοχή 366-542 του HIF-2α πιθανόν να περιέχει σήμα πυρηνικής εξαγωγής το οποίο επηρεάζεται άμεσα ή έμμεσα από τη δράση των ERK1/2.Επόμενο στόχο της διατριβής αποτέλεσε η διαλεύκανση του μηχανισμού δράσης του αναστολέα πρωτεασώματος βορτεζομίδη στην επαγωγή του HIF-1α σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη και του HIF-2α σε κύτταρα ηπατοκαρκινώματος. Βρέθηκε ότι η βορτεζομίδη μειώνει την επαγόμενη από την υποξία έκφραση του HIF-1α μέσω απενεργοποίησης του μονοπατιού PI3K/Αkt. Επίσης μειώνει και την επαγόμενη από την υποξία μεταγραφική ενεργότητα του HIF-1 μέσω αναστολής των ERK1/2 και μείωσης του πυρηνικού εντοπισμού του HIF-1α σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, η δράση της βορτεζομίδης στον HIF-2α σε κύτταρα ηπατοκαρκινώματος, φαίνεται να είναι διαφορετική. Η βορτεζομίδη δεν επηρεάζει την επαγόμενη από την υποξία έκφραση του HIF-2α αλλά μειώνει τη μεταγραφική του ενεργότητα.