Επιδημιολογικός, κλινικός και μοριακός έλεγχος ανοσοκατεσταλμένων γυναικών που μολύνθηκαν από τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων

Abstract

Nowadays, HPV (Human Papilloma Virus) infection is the most common disease among sexually transmitted diseases. At the same time, several studies have strongly implicated human papillomavirus (HPV) infection as a causative factor in the development of cervical cancer. Using sensitive Polymerase Chain Reaction (PCR) techniques, HPV-DNA is detected in almost 100% of invasive cervical cancers.However, the evolution of HPV infection depends on the virus type (oncogenic or not), the life status (smoking habits, sexual habits) and most important the immune system of the individual ( which will allow the virus to penetrate and cause a disease). All these factors are important for carcinogenesis by either making the infection more persistent or attributing to its evolution to cervical cancer. The knowledge of acting of these factors is vital in order to be able to understand the virus from the infection to the development of cancer. As a matter of fact, genetic alterations are necessary to influence the development of cancer by epigenetic modifications related to it.In fact, the prevalence of the HPV virus, is different among immunosuppressed women. Indeed in this group the severity of HPV-associated cervical disease has been linked to increasing immunological impairment. Therefore, for these immunocompromised patients, knowing the risk for HPV infection as well as their regular follow up, along with the use of new biomarkers for the early diagnosis of the disease, are of utmost importance.Epigenetic mechanisms such as DNA methylation, have been implicated in the pathogenesis of cancer, as they modify the regulation of gene expression, the cell differentiation and the predisposed cell death. Unnormal expression of DNA Methyltransferases has been involved in carcinogenesis by provoking either DNA hypomethylation or hypermethylation of nonmethylated CpG islands. This is why it is of great importance to understand the function of these proteins, in order to evaluate their potential as cancer markers.This case-control study consists of two groups of Greek women, immunosuppressed (by renal transplantation) and not, in order to examine and compare their enviromental factors and their immunosuppression with the HPV infection of their genital area along with the expression of Methyltransferases DNMT3A and DNMT3B.50 specimens of cervical smears and 50 specimens of vulva smears from immunosuppressed women, along with 100 specimens of cervical smears and 100 specimens of vulva smears of healthy women, were analyzed. The collection of smears was done by using an endocervical brush and cells were placed in sterilized tubes (Eppendorf) and stored at 00C prepared for molecular analysis of DNA and RNA.DNA was used in the PCR in order to detect HPV and then recognise each specific HPV type. At the same time pap smears were collected from each patient.RNA was used in the PCR in order to detect the expression of methyltransferases DNMT3A και DNMT3B.Then, the 14 immunosuppressed women and the 20 healthy women who had cervical cytological abnormalities and/or were HPV-DNA positive, were colposcopically tested and if aceto-whitening areas were seen targeted biopsies were performed.HPV-DNA test demonstrated that there was no statistically significant differences between cervical and vulva smears. Moreover, in the HPV typing process, was also shown, that the same HPV types are detected in the cervix and vulva of the same woman. Furthermore, HPV was detected in 28% of cases and in 20% of controls resulting no statistically significant differences between the two groups (p=0,35). Even in HPV typing there are no differences, as the most frequent HPV type is HPV53 in both groups. Regarding the prevalence of HPV infection, in both immunosuppressed patients and control group remains the same regardless of their age, their smoking habbits and their age at first intercourse. On the contrary, increased HPV prevalence in RTR (renal transplant recipients) is related to either 8 or more sexual partners during a lifetime or to more than 21 years of immunosuppression. As far as the detection of HPV infection, in both groups, is concerned, the cervical samples of our study revealed the superiority of HPV-DNA test against Papanikolaou smear (p=0,001). Moreover, in women with positive HPV-DNA test where cervical biopsies were taken, there were no significant differences, between cases and controls,in none of the CIN subgroups (CIN1 p=0,41, CIN2 p=0,62, CIN3 p=0,39). However, due to the small number of patients with CIN, there was no possibility to correlate CIN with specific HPV type.As mentioned before, DNMT3A and DNMT3B expression has a leading role in carcinogenesis of many organs such as in cervical cancer. In our study we made an effort to detect the expression of methyltransferases DNMT3A and DNMT3B in the cervical samples of both groups, and correlate the results with HPV infection, as for immunosuppressed patients very little data have been published.According to our results only the expression of DNMT3B, in the control group, is increased and statistically significant compared with DNMT3A in the same group (p=0,001) and with DNMT3B in immunosuppressed women. These are the first results to support the possibility of increased expression of DNMT3B in healthy women, or in another way, the reduced expression of DNMT3Β in immunosuppressed women to be correlated with the pharmaceutical immunosuppression of transplanted women and the different function of their immune system, but there is no report made in the literature. It is likely that if the research of DNMT3B expression was made in a larger amount of samples, together with a better understanding of the immune system of transplanted women, then we would have a better aspect of the function of DNMT3B in these patients together with its correlation with cervical cancer.During our research among the expression of DNA methyltransferases in samples with positive HPV-DNA test, DNMT3A was expressed in 62% of women with positive HPV-DNA test in both groups, whereas DNMT3B was expressed only in 12%. On the other hand, no correlation was found between DNA methyltransferases and a specific HPV type. However, if the amount of samples was bigger it would be easier to connect DNMT3A and DNMT3B with a specific HPV type.Taking into consideration the results from the literature concerning the positive influence of HPV16 and HPV18 on the levels of expression of DNA methyltransferases, we studied the correlation between the intensity of expression of DNMT3A and DNMT3B and HPV infection. According to our results, there is no statistical significant correlation neither between overexpression of DNA methyltransferases and HPV infection in both groups, nor between overexpression of DNMT3A and DNMT3B and women with CIN.In conclusion, our results support the belief that for transplanted women, the number of sexual partners and the years of immunosuppression are the dangerous factors for HPV infection and HPV53 is the most frequent type that infects them. Furthermore our results indicate the belief that organ transplant recipients are not anymore a high risk group concerning HPV infection of their genital area and CIN. These findings would be translated clinically to a cervical follow up in transplanted women according to their age or sexual habits and not according to their organ transplantation. It is obvious that in order to determine the regular cervical follow up of transplanted women, and to have a more clear vision of the correlation of DNA methyltransferases with HPV and CIN to use them as cancer markers, further larger scale studies are needed.

Η λοίμωξη από τους ιούς των ανθρωπίνων θηλωμάτων (Human Papilloma Viruses – HPV) αποτελεί σήμερα τη συχνότερη σεξουαλικά μεταδιδόμενη νόσο στις γυναίκες. Παράλληλα, έχει βρεθεί από βιβλιογραφικά δεδομένα ότι ο ιός των ανθρωπίνων θηλωμάτων (Human Papilloma Virus- HPV) είναι αυτός που κυρίως ενοχοποιείται για την ανάπτυξη καρκίνου στον τράχηλο της μήτρας. Χρησιμοποιώντας την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR-Polymerase Chain Reaction) το HPV-DNA ανιχνεύεται σε ποσοστό σχεδόν 100% στον διηθητικό καρκίνο του τραχήλου.Ωστόσο, η εξέλιξη της λοίμωξης από τον ιό HPV εξαρτάται από τον τύπο του ιού (ογκογόνο ή μη), από περιβαλλοντικούς παράγοντες (κάπνισμα, σεξουαλικές συνήθειες) και κυρίως από την κατάσταση του ανοσιακού συστήματος του ξενιστή (που θα επιτρέψει ή όχι να εμφανισθεί η αλλοίωση και να εξελιχθεί). Όλοι αυτοί οι παράγοντες είναι απαραίτητοι για τη διαδικασία καρκινογένεσης και δρουν είτε συμβάλλοντας στην επιμονή της λοίμωξης, είτε διεγείροντας την εξέλιξή της προς διηθητικό καρκίνο. Η γνώση της δράσης και της σημασίας αυτών των παραγόντων, αν και ατελής, είναι απαραίτητη για να κατανοήσουμε τη φυσική πορεία από την λοίμωξη μέχρι την εμφάνιση των αλλοιώσεων του επιθηλίου. Η ανάπτυξη διηθητικής νόσου προϋποθέτει τη συσσώρευση γενετικών αλλαγών, οι οποίες θα οδηγήσουν σε επιγενετικές αλλαγές που θα ενεργοποιήσουν την έκφραση των γονιδίων του ιού στο επιθηλιακό κύτταρο. Όσον αφορά όμως τον επιπολασμό του ιού σε ανοσοκατεσταλμένες γυναίκες, τα δεδομένα είναι λίγο διαφορετικά. Λόγω επηρεασμένης ανοσιακής απάντησης οι γυναίκες αυτές θεωρείται ότι είναι πιο επιρρεπείς στην εμφάνιση καρκίνου στο γεννητικό σύστημα μετά από μόλυνση από τον ιό HPV. Γι'αυτό για τις γυναίκες αυτές είναι μεγίστης σημασίας η διερεύνηση του τρόπου δράσης του ιού σε αυτές, η τακτική παρακολούθησή τους μέσω των διαγνωστικών τεχνικών αλλά και η ανάπτυξη βιολογικών δεικτών που θα επέτρεπαν τη διάγνωση της νόσου σε πρώιμα στάδια.Επιγενετικά φαινόμενα, όπως η μεθυλίωση του DNA, πιστεύεται πως συνδέονται άμεσα με την παθογένεια του καρκίνου, καθώς διαταράσσουν τη φυσιολογική έκφραση των γονιδίων που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο, τη διαφοροποίηση και τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Μη φυσιολογική έκφραση των DNA μεθυλοτρανσφερασών έχει συσχετισθεί με την καρκινογένεση προκαλώντας, είτε εκτενή υπομεθυλίωση των φυσιολογικά μεθυλιωμένων περιοχών του επαναλαμβανόμενου DNA, είτε τοπική υπερμεθυλίωση των φυσιολογικά μη μεθυλιωμένων CpG νησίδων. Επομένως είναι σημαντική η διερεύνηση αυτών των πρωτεϊνών, ώστε να αξιολογηθεί και η πιθανή χρήση τους ως καρκινικών δεικτών.Η παρούσα συγκριτική μελέτη ασθενών-μαρτύρων (cases-controls) αφορά σε δύο ομάδες Ελληνίδων γυναικών, ανοσοκατεσταλμένων (λόγω μεταμόσχευσης νεφρού) και μη, σχετικά με την διερεύνηση της συσχέτισης τόσο των επιδημιολογικών τους χαρακτηριστικών, όσο και των παραγόντων της ανοσοκαταστολής τους, με την μόλυνση της γεννητικής περιοχής τους από τον ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων και με την έκφραση των μεθυλοτρανσφερασών DNMT3A και DNMT3B. Συγκεκριμένα, ως υλικό της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν 50 τραχηλικά και 50 επιχρίσματα αιδοίου μεταμοσχευμένων γυναικών, και 100 τραχηλικά και 100 επιχρίσματα αιδοίου υγιών εθελοντριών γυναικών. Η λήψη έγινε με ειδική ψήκτρα, το κυτταρικό υλικό τοποθετήθηκε σε ειδικά αποστειρωμένα πλαστικά φιαλίδια Εppendorf (διατηρημένα σε συνθήκες κατάψυξης, για να μην αλλοιωθεί το γενετικό υλικό), και στη συνέχεια μεταφέρθηκε στο εργαστήριο με σκοπό την απομόνωση τόσο DNA, όσο και RNA απ' όλα τα δείγματα. Στο πρώτο σκέλος της μελέτης το DNA χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση με PCR του HPV και την τυποποίηση του πιθανόν ανιχνευόμενου HPV τύπου. Παράλληλα, από όλες τις ασθενείς έγινε και λήψη τεστ Παπανικολάου.'Οσον αφορά στο RNA των δειγμάτων, αυτό χρησιμοποιήθηκε στο δεύτερο σκέλος της μελέτης για τον έλεγχο με PCR της έκφρασης των μεθυλοτρανσφερασών DNMT3A και DNMT3B. Στη συνέχεια, στις 14 μεταμοσχευμένες και στις 20 υγιείς με παθολογικά κυτταρολογικά ευρήματα, ή/και εύρεση μολύνσεων από τύπους HPV, οι γυναίκες εκλήθησαν για περαιτέρω έλεγχο με κολποσκόπηση και βιοψία από τον τράχηλο της μήτρας.Σχετικά με τα HPV DNA test, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι δεν υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά σχετικά με την προέλευση των δειγμάτων (τράχηλος ή αιδοίο), όπως επίσης στη συνέχεια όπου αναλύονται οι τύποι του HPV, φαίνεται ότι σχεδόν πάντα οι ίδιοι τύποι του ιού προσβάλλουν ταυτόχρονα τον τράχηλο και το αιδοίο της ίδιας γυναίκας.Ανάλυση των δειγμάτων ανέδειξε ότι στις μεταμοσχευμένες θετικό HPV DNA test έχει το 28% ενώ αντίστοιχα στις φυσιολογικές το 20% και επομένως δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στα δύο γκρουπ (p=0,35). Μάλιστα, ακόμα και στην τυποποίηση του ιού δεν υπάρχει διαφορά, καθώς ο συχνότερος τύπος του ιού είναι ο HPV53 και στις δύο ομάδες γυναικών. Επιπλέον, βρέθηκε ότι ούτε η ηλικία των γυναικών αλλά ούτε και οι συνήθειες καπνίσματος ή η ηλικία έναρξης σεξουαλικών επαφών, σε καμία από τις δύο ομάδες, δεν συσχετίζεται με την μόλυνσή τους από τον ιό. Αντίθετα, οι ιοί HPV προσβάλουν συχνότερα μεταμοσχευμένες γυναίκες που έχουν περισσότερους από 8 σεξουαλικούς συντρόφους κατά τη διάρκεια της ζωής τους ή που βρίσκονται σε ανοσοκαταστολή για περισσότερο από 21 χρόνια. Στα τραχηλικά επιχρίσματα της μελέτης μας ήταν έκδηλη η υπεροχή του HPV DNA test σε σχέση με το τεστ Παπανικολάου (p=0,001) σε ότι αναφορά την ανίχνευση λοίμωξης από τον ιό και στις δύο ομάδες γυναικών. Στη συνέχεια, από τη μελέτη των βιοψιών στις γυναίκες με τα θετικά HPV DNA test δεν βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά, ανάμεσα στις δύο ομάδες γυναικών, σε καμία από τις υποομάδες CIN (CIN1 p=0,41, CIN2 p=0,62, CIN3 p=0,39). Όμως, λόγω του περιορισμένου αριθμού ασθενών με CIN, δεν υπήρξε δυνατότητα για συσχέτιση του CIN με συγκεκριμένο τύπο HPV.Όπως ήδη αναφέρθηκε, η έκφραση των DNMT3A και DNMT3B παίζει κυρίαρχο ρόλο στην διαδικασία της καρκινογένεσης σε πολλά όργανα και ιστούς, όπως επίσης και στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Στο δεύτερο σκέλος της μελέτης μας προσπαθήσαμε να ελέγξουμε την έκφραση των μεθυλοτρανσφερασών DNMT3A και DNMT3B στο κυτταρικό υλικό από τον τράχηλο της μήτρας των δύο ομάδων γυναικών και να συσχετίσουμε αυτά τα ευρήματα με την μόλυνση από δεδομένους τύπους του ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV), καθώς πολύ λίγα δεδομένα έχουν αναφερθεί στην βιβλιογραφία για μεταμοσχευμένες ασθενείς.Σύμφωνα με τα ευρήματά μας, μόνο η έκφραση της DNMT3B στην ομάδα ελέγχου είναι αυξημένη με στατιστική σημαντικότητα σε σύγκριση με την DNMT3Α στην ίδια ομάδα (p=0,001), καθώς και με την DNMT3Β στις μεταμοσχευμένες γυναίκες. Είναι τα πρώτα αποτελέσματα που υποστηρίζουν ότι, υπάρχει περίπτωση η αυξημένη έκφραση της DNMT3Β στις υγιείς γυναίκες ή αν το δούμε από την άλλη πλευρά, η απενεργοποίηση της έκφρασης της DNMT3B στις μεταμοσχευμένες γυναίκες να σχετίζεται με την φαρμακευτική ανοσοκαταστολή των μεταμοσχευμένων και την διαφορετική λειτουργία του ανοσιακού τους συστήματος, αλλά παρόμοια αναφορά στην βιβλιογραφία δεν υπάρχει. Ενδεχομένως, η μελέτη της ποσοτικοποίησης της έκφρασης της DNMT3Β, σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων και με περαιτέρω ανάλυση του ανοσιακού συστήματος των μεταμοσχευμένων, να έδινε μια πιο σαφή εικόνα για τον τρόπο λειτουργίας της DNMT3Β σε αυτές τις ασθενείς και για τη συσχέτισή της με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Στην προσπάθεια μας να ελέγξουμε την έκφραση των DNA μεθυλοτρανσφερασών στα δείγματα με θετικό HPV DNA test, βρήκαμε ότι η DNMT3A εκφράζεται στο 62% των γυναικών με θετικό HPV DNA test και στις δύο ομάδες γυναικών, ενώ η DNMT3B εκφράζεται μόνο στο 12%. Ωστόσο δεν βρέθηκε συσχέτιση ανάμεσα στις DNA μεθυλοτρανσφεράσες και σε συγκεκριμένο τύπο HPV. Και πάλι εάν ο αριθμός των δειγμάτων προς εξέταση ήταν μεγαλύτερος ίσως θα μπορούσαμε να βρούμε συσχέτιση ανάμεσα στις DNMT3A και DNMT3B και σε συγκεκριμένο τύπο HPV. Έπειτα έχοντας υπ'όψιν μας τη διεθνή βιβλιογραφία και την θετική επίδραση των HPV16 και 18 στα επίπεδα έκφρασης των μεθυλοτρανσφερασών, διερευνήσαμε την συσχέτιση της έντασης της έκφρασης των DNMT3A και DNMT3B με την λοίμωξη με HPV. Σύμφωνα όμως με τα αποτελέσματά μας, δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική σχέση ανάμεσα στην υπερέκφραση των μεθυλοτρανσφερασών και στην HPV λοίμωξη και στις δύο ομάδες γυναικών.Τέλος στατιστική συσχέτιση δεν βρέθηκε ούτε ανάμεσα στην υπερέκφραση των DNMT3A και DNMT3B και στις γυναίκες με κάποιο βαθμό CIN.Συμπερασματικά, τα δεδομένα της παρούσας μελέτης καταδεικνύουν ότι στις μεταμοσχευμένες γυναίκες ο αριθμός των σεξουαλικών τους συντρόφων και τα χρόνια της ανοσοκαταστολής είναι οι επικίνδυνοι παράγοντες για λοίμωξή τους από τους ιούς HPV, με τον HPV53 να είναι ο συχνότερος τύπος του ιού που τις προσβάλλει. Επιπλέον τα αποτελέσματά μας τονίζουν την τάση οι μεταμοσχευμένες γυναίκες να μην αποτελούν πια ιδιαίτερη ομάδα υψηλού κινδύνου για λοίμωξη της γεννητικής περιοχής από τους ιούς HPV και ανάπτυξη CIN. Αυτή η διαπίστωση οδηγεί κλινικά τις μεταμοσχευμένες γυναίκες να συμμετέχουν στον προληπτικό έλεγχο του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, σύμφωνα με την ηλικία τους και τις σεξουαλικές τους συνήθειες και όχι σύμφωνα με τις συνθήκες μεταμόσχευσής τους. Είναι φανερό ότι απαιτούνται εκτεταμένες μελέτες με μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων σε μεταμοσχευμένες γυναίκες, τόσο για να καθοριστούν οι προδιαγραφές για τον προληπτικό τους έλεγχο σε ότι αφορά τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, όσο και για να υπάρξει μια πιο σαφή εικόνα της συσχέτισης των DNΑ μεθυλοτρανσφερασών με την ανοσοκαταστολή, με τον HPV και το CIN στην ιδιαίτερη αυτή ομάδα ασθενών, έτσι ώστε να αξιολογηθεί αν είναι δυνατή η χρήση τους ως καρκινικών δεικτών.