Μελέτη του ρόλου της νεφρίνης και των νεφρινο-συνδεόμενων πρωτεϊνων στη σηματοδότηση και στη φυσιολογία των παγκρεατικών β-κυττάρων

Abstract

In this study, we investigated the potential role of nephrin in the regulation of pancreatic beta cell survival. We utilized endogenous nephrin expression in βTC-6 cells and demonstrated that nephrin was associated and co-localized with PI3K in both, mouse islet β-cells and βTC-6 cells. To further investigate the interaction between nephrin and PI3-kinase, we used specific anti-nephrin antibodies to assess the effect of nephrin–ligand binding on nephrin signaling. Incubation of cells with anti-nephrin antibodies induced nephrin clustering at the plasma membrane, phosphorylation of 1176/1193 tyrosine residues of nephrin and recruitment of PI3K to clustered nephrin. PI3K recruitment resulted in activation of PI3K, since it was associated with increased phosphorylation/activation of Akt. Nephrin-induced Akt phosphorylation was completely inhibited by the PI3K inhibitors wortmannin and LY294002, demonstrating that phosphorylation of Akt is PI3K-dependent. Clustering-induced nephrin tyrosine phosphorylation, PI3K recruitment to clustered nephrin and Akt phosphorylation were also inhibited by PP1, a specific inhibitor of Src tyrosine kinases, indicating that Src family kinases mediate nephrin signaling by phosphorylating nephrin on tyrosine residues. According to our results, nephrin–PI3K-induced Akt activation was accompanied by phosphorylation, hence inhibition, of pro-apoptotic Bad protein and suppression of FoxO1/3a transcription factors. In addition, silencing of nephrin expression resulted in impairment of nephrin-induced Akt activation accompanied by increased susceptibility of cells to apoptosis. Moreover, we demonstrated that short-term exposure of cultured βTC-6 cells to increased glucose concentration inhibited clustering-induced nephrin phosphorylation and impaired Akt activation, without affecting nephrin expression. Glucose-induced attenuation of nephrin signaling was attributed to increased PKCα-dependent nephrin internalization. Interestingly, a marked decrease in nephrin expression and phosphorylated Akt was observed in pancreatic islets of diabetic (db/db lepr−/−) mice. Therefore, gradual reduction of nephrin expression and signaling in islet beta-cells may further contribute to the defective insulin signaling within β-cell and β-cell insulin resistance, thus leading to the loss of β-cell function and mass which occurs in type 2 diabetes. In conclusion, the work described herein unraveled and established a pivotal role for nephrin in the regulation of pancreatic beta-cell survival signaling. Our data suggest that gradual reduction of nephrin expression and signaling accompanied by decreased Akt activity in long-standing hyperglycemia may contribute to pancreatic beta-cell loss/apoptosis observed in type 2 diabetes.

Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος της νεφρίνης στη ρύθμιση της επιβίωσης των παγκρεατικών β-κυττάρων. Αρχικά, δείξαμε ότι η νεφρίνη διασυνδέεται/αλληλεπιδρά με την PI3Κ in vitro στα βTC-6 κύτταρα καθώς και in situ στα β-κύτταρα των νησιδίων ποντικών. Προκειμένου να μελετήσουμε περαιτέρω την αλληλεπίδραση της νεφρίνης με την PI3Κ, χρησιμοποιήσαμε ειδικά αντισώματα έναντι της εξωκυτταρικής περιοχής της νεφρίνης, τα οποία οδηγούν στη συνάθροιση της νεφρίνης στην κυτταρική μεμβράνη, στη φωσφορυλίωσή της στις τυροσίνες 1176/1193 και στη στρατολόγηση της PI3Κ στη συναθροισμένη νεφρίνη. Η στρατολόγηση της PI3Κ οδήγησε στην ενεργοποίησή της, όπως αυτή διαπιστώθηκε από την παράλληλη αύξηση της φωσφορυλίωσης/ενεργοποίησης της κινάσης Akt. Με τη χρήση ειδικών αναστολέων της PI3Κ, τεκμηριώσαμε την εξαρτώμενη από την PI3Κ φωσφορυλίωση της Akt. Επιπροσθέτως, η επώαση των κυττάρων με τον ειδικό αναστολέα των Src κινασών, PP1, ανέστειλε την επαγόμενη από τη συνάθροιση της νεφρίνης φωσφορυλίωσή της στις τυροσίνες 1176/1193, την στρατολόγηση της PI3K στη συναθροισμένη νεφρίνη και τη φωσφορυλίωση της Akt, αποδεικνύοντας ότι οι Src κινάσες διαμεσολαβούν τη σηματοδότηση της νεφρίνης φωσφορυλιώνοντάς την σε κατάλοιπα τυροσίνης. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, η ενεργοποίηση της Akt, που επάγεται από την αλληλεπίδραση της νεφρίνης με την PI3Κ, συνοδεύεται από φωσφορυλίωση/αναστολή της προ-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bad καθώς και των προ-αποπτοτικών μεταγραφικών παραγόντων FoxO1/3a. Η αποσιώπηση της έκφρασης της νεφρίνης ανέστειλε την επαγόμενη από τη νεφρίνη ενεργοποίηση της Akt και παράλληλα αύξησε την ευαισθησία των κυττάρων στην απόπτωση. Στη συνέχεια, αποδείξαμε ότι η βραχυπρόθεσμη έκθεση καλλιεργημένων βΤC-6 κυττάρων σε υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης αναστέλλει τη φωσφορυλίωση της νεφρίνης και εξασθενεί τη φωσφορυλίωση/ενεργοποίηση της Akt, που επάγεται από τη συνάθροιση της νεφρίνης, χωρίς να επηρεάζεται η έκφραση της νεφρίνης. Επίσης, στα καλλιεργημένα βTC-6 κύτταρα, η υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης οδήγησε σε αύξηση της ενδοκυττάρωσης της νεφρίνης, ενδεχομένως με τρόπο εξαρτώμενο από την ΡΚCα. Τα ανοσοϊστοχημικά αποτελέσματά μας σε παγκρεατικά νησίδια διαβητικών (db/db lepr-/-) ποντικών με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 αποκάλυψαν την in vivo μείωση της έκφρασης της νεφρίνης, η οποία συνοδεύτηκε από σημαντική μείωση της φωσφορυλιωμένης κινάσης Akt. Ως εκ τούτου, η σταδιακή μείωση της έκφρασης και σηματοδότησης της νεφρίνης, πιθανόν να συνεισφέρει στο αλλοιωμένο ινσουλινο-σηματοδοτικό μονοπάτι στα β-κύτταρα επιδεινώνοντας την αυξανόμενη ινσουλινοαντίσταση των β-κυττάρων και οδηγώντας στην απώλεια της λειτουργίας και στη μείωση της μάζας των β-κυττάρων που χαρακτηρίζουν την παθογένεση του σακχαρώδους διαβήτη τύπου 2. Συνολικά τα ανωτέρω αποτελέσματα, αποκαλύπτουν και τεκμηριώνουν τον κεντρικό ρόλο της νεφρίνης στην προαγωγή της επιβίωσης των παγκρεατικών β-κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας προτείνουν ότι στη χρόνια υπεργλυκαιμία, η σταδιακή μείωση της έκφρασης και σηματοδότησης της νεφρίνης συνοδευόμενη από μειωμένη ενεργότητα της κινάσης Akt, πιθανόν να συμβάλλει στην απώλεια/απόπτωση των β-κυττάρων που παρατηρείται στον σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2.