Φαινοτυπική και γονοτυπική μελέτη της ανθεκτικότητας του Ureaplasma urealyticum στη Βόρειο Ελλάδα

Abstract

Introduction: U.urealyticum spp. is a microorganism widespread in humans, colonizing various areas of the body. It often causes acute and chronic infections. As the microorganism is deprived of cell wall, the treatment options are mainly limited to quinolones, macrolides and tetracyclines. The limited production of new antimicrobials dictates the need for proper and efficient administration of the existing ones. The world scientific community is already sensitized, as ureaplasma has already acquired resistance levels to some of the administered antimicrobial agents.Aim: The purpose of this research was to test the resistance to used antimicrobials of strains of U.urealyticum spp., circulating in Northern Greece, both in phenotypic and genotypic level.Material and Methods: This was a cross-sectional study in relation to prevalence, which included testing the resistance of U.urealyticum spp. to current antimicrobials, with conventional and molecular techniques. The material of the study consisted of 100 positive U.urealyticum spp. samples from Thessaloniki hospitals, which were isolated during 2010-2011. The clinical samples were cervical smears in women and urethral exudates in men, which were cultured in A7 agar for isolation of the microorganism. All the selected 100 U.urealyticum spp. positive samples had a microbe concentration >104 CFU/ml and there was no co-infection of the genital tract of patients with another pathogen or other genital mycoplasmas. A phenotypic resistance test followed, with a standardized method. Real-time PCR for detection of urease gene in samples with positive culture was performed in order to confirm the identification of the microorganism. Molecular separation of U.urealyticum spp. species and molecular separation of U.parvum isolates to their genotypes was also performed. To detect possible mutations in subunits-targets of the antimicrobials used, all subunits-targets of quinolones in all strains and all subunits-targets of macrolides in non-susceptible strains were enhanced, while the presence of tetM gene which is associated with tetracycline resistance was tested in all isolates. The detection of the urease and tetM gene was perfomed by Real Time PCR technique for the first time in the international bibliography. Sequencing of amplicons for quinolones and macrolides in selected strains and comparison of these sequences with the corresponding reference strains was made. The statistical method x2 and its variants were used. Statistics was performed with the statistical program SPSS 17.0. Results: The frequency of U.urealyticum spp. in healthy asymptomatic women aged 20-70 years old in Northern Greece was found in percentage of 16.13%. The healthy carriers of the organism at high concentrations (≥ 104 CFU/ml) are mostly women of childbearing age, while U.parvum was found to be the dominant species in the microorganism strains. The tetracycline group qualifies as the most effective treatment (resistance 0%), followed by macrolides (resistance 4%), while the resistance of the microorganism to quinolones is particularly high (>50%). Ofloxacin predominates significantly ciprofloxacin in sensitivity to all U.urealyticum spp. positive samples regarding both species of microorganism. At the molecular level, most nucleotide/aminoacid changes to quinolones happen to the protein subunits of topoisomerase IV, in particular subunit ParC. Regarding macrolides, low MIC strains exhibit mutations in already known targets of these antibiotics. The tetracycline resistance gene tetM was detected in more than a third of phenotypically susceptible strains of U.urealyticum spp.. Eleven new polymorphisms were detected in the subunit ParC, 1 in ParE subunit for quinolones and 1 new mutation in the protein L22 gene for macrolides. These mutations have never been reported earlier in literature. There was no correlation between the clinical picture and the presence or not of mutations and resistance genes.Conclusions: The frequency of the healthy carriers of the organism is estimated at about one out of six people in northern Greece, the highest percentage of positive samples in women of childbearing age. Fluoroquinolones should be used with caution and if a choice is possible, ofloxacin is recommended. There was no statistical difference betweeen strains that were isolated from patients and from healthy carriers, in terms of sensitivity to quinolones. Eleven new polymorhisms were detected in the subunit ParC, 1 in ParE subunit for quinolones and 1 in the protein L22 gene for macrolides. It was found that strains possessing different specific mutations exhibit similarities in phenotypic sensitivity, leading to the assumption that all mutations are not strongly associated with resistance. Also, the importance of the presence of tetM gene is assessed with caution. In conclusion, a) the administration of antimicrobial treatment should be appropriate to be based on phenotypic resistance test, instead of the use of the empirical therapy that is usually occurs in clinical practice b) regarding the epidemiological surveillance of U.urealyticum spp. the correlation of the phenotypic resistance with the genotypic profile is significant.

Εισαγωγή: Το U.urealyticum spp. είναι ένας μικροοργανισμός πολύ διαδεδομένος στον άνθρωπο, που αποικίζει διάφορες περιοχές του σώματός του και συχνά προκαλεί οξείες ή χρόνιες λοιμώξεις. Καθώς ο μικροοργανισμός στερείται κυτταρικού τοιχώματος, η αντιμετώπιση των λοιμώξεων που προκαλεί περιορίζεται κυρίως στις κινολόνες, τις μακρολίδες και τις τετρακυκλίνες. Η περιορισμένη πλέον παραγωγή νέων αντιμικροβιακών καθιστά επιτακτική την ανάγκη ορθής και αποτελεσματικής χορήγησης αυτών που υπάρχουν. Η παγκόσμια επιστημονική κοινότητα είναι ήδη ευαισθητοποιημένη, καθώς τα ουρεαπλάσματα έχουν ήδη από ετών αποκτήσει ικανά επίπεδα ανθεκτικότητας σε ορισμένα από τα χορηγούμενα αντιμικροβιακά. Σκοπός: Σκοπός αυτής της έρευνας ήταν να ελέγξει την ανθεκτικότητα των στελεχών του U.urealyticum spp., που κυκλοφορούν στη Βόρεια Ελλάδα, στα χρησιμοποιούμενα αντιμικροβιακά φάρμακα, σε φαινοτυπικό όσο και σε γονιδιακό επίπεδο.Υλικό και μέθοδος: Επρόκειτο για συγχρονική μελέτη (cross-sectional study) χρονικής στιγμής σε σχέση με τον επιπολασμό, η οποία περιλαμβάνει έλεγχο της ανθεκτικότητας του U.urealyticum spp. στα χρησιμοποιούμενα αντιμικροβιακά με συμβατικές και μοριακές τεχνικές. Το υλικό της εργασίας αποτέλεσαν 100 θετικά δείγματα για U.urealyticum spp. που προήλθαν από νοσοκομεία της Θεσσαλονίκης, το διάστημα 2010-2011. Τα κλινικά δείγματα ήταν τραχηλικά επιχρίσματα γυναικών και ουρηθρικά εκκρίματα ανδρών, στα οποία ο μικροοργανισμός απομονώθηκε με καλλιέργεια σε άγαρ Α7. Και τα 100 θετικά δείγματα για U.urealyticum spp. που επιλέχθηκαν είχαν συγκέντρωση μικροβίου >104 CFU/ml και δεν υπήρχε συλλοίμωξη του γεννητικού συστήματος των ασθενών με άλλο γεννητικό μυκόπλασμα. Ακολούθησε φαινοτυπικός έλεγχος ανθεκτικότητας του μικροοργανισμού με προτυποποιημένη μέθοδο. Επιβεβαιωτικά έγινε ανίχνευση του γονιδίου της ουρεάσης με real-time PCR στα δείγματα με θετική καλλιέργεια. Πραγματοποιήθηκε μοριακός διαχωρισμός του U.urealyticum spp. στα είδη του και μοριακός διαχωρισμός στελεχών U.parvum στους γονοτύπους τους. Για την ανίχνευση πιθανών μεταλλάξεων στις υπομονάδες-στόχους των χρησιμοποιούμενων αντιμικροβιακών, έγινε ενίσχυση όλων των υπομονάδων-στόχων των κινολονών σε όλα τα στελέχη, όλων των υπομονάδων-στόχων των μακρολιδών στα μη ευαίσθητα στελέχη και του γονιδίου tetM για τις τετρακυκλίνες σε όλα τα στελέχη. Η ανίχνευση των γονιδίων ουρεάσης και tetM πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά βιβλιογραφικά με εφαρμογή τεχνικών Real Time PCR. Ακολούθησε αλληλούχηση των προϊόντων ενίσχυσης για τις κινολόνες και τις μακρολίδες σε επιλεγμένα στελέχη και έγινε σύγκριση των αλληλουχιών με αυτές των αντίστοιχων πρότυπων στελεχών. Για τη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος χ2 και οι παραλλαγές της και το στατιστικό πρόγραμμα SPSS 17.0. Αποτελέσματα: Η συχνότητα ανεύρεσης του U.urealyticum spp. σε υγιείς ασυμπτωματικές γυναίκες ηλικίας 20-70 ετών στην Βόρεια Ελλάδα βρέθηκε σε ποσοστό 16,13%. Οι υγιείς φορείς του μικροοργανισμού σε υψηλές συγκεντρώσεις (≥104CFU/ml) είναι στην πλειοψηφία τους γυναίκες σε αναπαραγωγική ηλικία, ενώ το κυρίαρχο είδος στα στελέχη του μικροοργανισμού βρέθηκε το U.parvum. Η ομάδα των τετρακυκλινών προκρίνεται, ως η πιο αποτελεσματική φαινοτυπικώς θεραπευτική αγωγή (αντοχή 0%), ακολουθούμενη από τις μακρολίδες (αντοχή 4%), ενώ αντίθετα η ανθεκτικότητα του μικροοργανισμού στις κινολόνες είναι ιδιαίτερα υψηλή (>50%). Η οφλοξασίνη υπερέχει στατιστικά σημαντικά της σιπροφλοξασίνης ως προς την ευαισθησία στο σύνολο των θετικών δειγμάτων για U.urealyticum spp., και στα δύο είδη του μικροοργανισμού. Οι περισσότερες νουκλεοτιδικές/αμινοξικές αλλαγές που σχετίζονται με ανθεκτικότητα στις κινολόνες σημειώνονται στις πρωτεϊνικές υπομονάδες της τοποϊσομεράσης IV, ειδικότερα στην υπομονάδα ParC. Σε ότι αφορά τις μακρολίδες, στελέχη με χαμηλές MIC εμφανίζουν μεταλλάξεις στους γνωστούς στόχους των εν λόγω αντιβιοτικών. Σε περισσότερα από το ένα τρίτο των φαινοτυπικώς ευαίσθητων στελεχών του U.urealyticum spp. στις τετρακυκλίνες ανιχνεύθηκε το γονίδιο ανθεκτικότητας tetM. Ανιχνεύθηκαν 11 νέοι πολυμορφισμοί στην υπομονάδα ParC, 1 στην υπομονάδα ParE για τις κινολόνες και 1 στο γονίδιο της πρωτεΐνης L22 για τις μακρολίδες, που αναφέρονται για πρώτη φορά διεθνώς. Δεν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της κλινικής εικόνας και της παρουσίας ή όχι μεταλλάξεων και γονιδίων ανθεκτικότητας.Συμπεράσματα: Οι υγιείς φορείς του μικροοργανισμού υπολογίζονται σε περίπου μία στις 6 γυναίκες στη Βόρεια Ελλάδα, με το υψηλότερο ποσοστό στην αναπαραγωγική ηλικία. Οι κινολόνες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται με περίσκεψη και αν υπάρχει η δυνατότητα επιλογής, συνιστάται η οφλοξασίνη. Τα στελέχη που απομονώθηκαν από ασθενείς και φορείς δεν διέφεραν στατιστικά ως προς την ευαισθησία στις κινολόνες. Ανιχνεύθηκαν νέοι πολυμορφισμοί που αναφέρονται για πρώτη φορά διεθνώς. Διαπιστώθηκε ότι στελέχη με την ίδια φαινοτυπική ευαισθησία παρουσιάζουν διαφορετικές μεταλλάξεις, που οδηγούν στην υπόθεση ότι όλες οι μεταλλάξεις δεν σχετίζονται ισχυρά με ανθεκτικότητα. Επίσης, η σημασία της παρουσίας του γονιδίου tetM αξιολογείται με περίσκεψη. Συμπερασματικά: α) η χορηγούμενη θεραπευτική αγωγή καλόν είναι να βασίζεται στον έλεγχο φαινοτυπικής ευαισθησίας του μικροοργανισμού, αντί της εμπειρικής θεραπείας που συνήθως δίνεται στην καθ’ημέρα κλινική πράξη β) για την επιδημιολογική επιτήρηση του U.urealyticum spp. έχει σημασία η συσχέτιση της φαινοτυπικής ανθεκτικότητας με το γονοτυπικό του προφίλ.