Λειτουργικές αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών με υποδοχείς που συζεύγνυνται με G πρωτεΐνες

Abstract

Opioid receptors belong to the superfamily of G protein coupled receptors (GPCRs) and regulate analgesia and tolerance-dependence to narcotic drugs. A new family of proteins, RGS proteins (Regulators of G protein Signalling), are involved in the signalling of GPCRs by accelerating the rate of GTP hydrolysis from Gα subunits, thus terminating signal transduction. The aim of the research was to study the interactions of μ- and δ-opioid receptors (μ-OR, δ-OR) with RGS4 protein and the role of RGS4 in receptor signalling. In vitro pulldown experiments using GST-/MBP-fusion peptides demonstrated that RGS4 binds to the third intracellular loop and the conserved region of the carboxyl tails of opioid receptors (μ-CT, δ-CT). RGS4 functions as a scaffold protein and promotes the binding of Gα subunit to the μ-CT, forming a RGS4–Gα–μ-CT ternary complex. Co-immunoprecipitation experiments showed that RGS4 promotes interaction of μ-OR, δ-OR with specific Gα subunit subtypes, depending on receptor activation. Functional experiments demonstrated that RGS4 a) increases intracellular cAMP accumulation by reducing opioid receptor adenyl cyclase inhibition, b) inhibits ERK phosphorylation, c) colocalizes with activated receptors. The N terminal of RGS4 is responsible for the protein’s functional activity. The results of this study indicate that RGS4 protein is a key element for the regulation and specificity of opioid receptor signalling.

Οι οπιοειδείς υποδοχείς ανήκουν στους υποδοχείς που συζεύγνυνται με G πρωτεΐνες (GPCRs) και ρυθμίζουν την αναλγησία και την ανοχή-εξάρτηση σε ναρκωτικές ουσίες. Στη σηματοδότηση των GPCRs εμπλέκεται μια νέα οικογένεια πρωτεϊνών, οι RGS πρωτεΐνες (Regulators of G protein Signaling), που επιταχύνουν το ρυθμό υδρόλυσης του GΤΡ από τις Gα υπομονάδες, τερματίζοντας έτσι τη μετάδοση του ερεθίσματος. Σκοπός της διατριβής ήταν να μελετηθούν οι αλληλεπιδράσεις των μ- και δ-οπιοειδών υποδοχέων (μ-OR, δ-OR) με την RGS4 πρωτεΐνη και ο ρόλος της RGS4 στη σηματοδότησή τους. Πειράματα in vitro πρόσδεσης με τη χρήση GST-/MBP-χιμαιρικών πεπτιδίων απέδειξαν ότι η RGS4 προσδένεται στην τρίτη ενδοκυτταρική θηλιά και στο συντηρημένο τμήμα των καρβοξυτελικών άκρων των οπιοειδών υποδοχέων (μ-CT, δ-CT). Η RGS4 λειτουργεί επίσης ως ικρίωμα και προάγει την πρόσδεση της Gα υπομονάδας στο μ-CT, σχηματίζοντας ένα ετεροτριμερές σύμπλοκο RGS4–Gα–μ-CT. Πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης έδειξαν ότι η RGS4 προάγει την αλληλεπίδραση των μ-OR, δ-OR με συγκεκριμένους υποτύπους Gα υπομονάδων, ανάλογα με την κατάσταση ενεργοποίησης των υποδοχέων. Λειτουργικά πειράματα έδειξαν ότι η RGS4 α) μειώνει την αναστολή της αδενυλικής κυκλάσης, αυξάνοντας τα ποσοστά του διαθέσιμου ενδοκυτταρικού cAMP, β) αναστέλλει τη φωσφορυλίωση των ERK κινασών, γ) συνεντοπίζεται με τους ενεργοποιημένους υποδοχείς. Για αυτές τις λειτουργικές επιδράσεις ευθύνεται το αμινοτελικό άκρο της RGS4. Τα αποτελέσματα της διατριβής δεικνύουν ότι η RGS4 πρωτεΐνη είναι ένα μόριο-κλειδί για την ρύθμιση και εξειδίκευση της σηματοδότησης των οπιοειδών υποδοχέων.