Η συμμετοχή του υποδοχέα CD44 και των βιοσυνθετικών και καταβολικών ενζύμων του υαλουρονικού οξέος στον καρκίνο του παχέος εντέρου

Abstract

Colon cancer comes third worldwide in men and fourth in women. During progression to colon cancer, the first disorder observed is the increase of the cells number (hyperplasia) at the intestinal epithelial surface. As a result, adenomas formed increase in size and number, without invading in neighboring structures. Some of the adenomas can become in situ cancer and finally invasive cancer. Extracellular matrix surrounds the cells and supports their growth into the tissues. Particularly, the molecules of the extracellular matrix interact with the cells, signal them and affect important cellular functions, such as recognition between cells, cell adhesion, migration, proliferation and differentiation. In cancer, structural changes take place in the synthesis and degradation of the extracellular matrix, leading to increased deposition of molecules in the matrix. As normal cells become cancerous, the extracellular matrix is modified in such a way that promotes the secretion of molecules, which further promote the growth of cancer cells and promote processes such as filtration and metastasis. The extracellular matrix, therefore, is one that provides in tumor cells survival signals, such as proliferation, motility, infiltration and metastasis. Hyaluronan is a main component of the extracellular matrix, which participates in a variety of molecular functions, which contribute both to structural features of the tissue and on the cell behavior during the formation or reorganization of tissues. Most cancers are characterized by an increased accumulation of hyaluronan. In most normal biological processes, large molecules of hyaluronan are usually found, whereas in cancerous conditions small molecules of hyaluronan are mostly found, which are considered to facilitate the mobility of cancer cells and infiltration. In the production of molecules of hyaluronan, its biosynthetic enzymes play catalytic role, hyaluronan synthases (HAS1, HAS2, HAS3), and its catabolic enzymes, hyaluronidases (Hyal-1, -2, -3, PH-20). The three synthases, while they have high homology in their sequence, they differ in the sizes of synthesized molecules. Hyaluronidases have also high degree of homology, they are transcriptionally active and their expression depends on the type of tissue in which they are expressed. During tumor development differential expression of synthases is observed and the transcriptional regulation of genes allows the cells to modulate the extracellular environment so as to favor tumor growth and metastasis. Additionally, numerous studies show differential hyaluronidase expression in cancer, which suggests that cancer cells use hyaluronidase to cleave hyaluronan in tissues and thereby facilitate tumor invasion. Furthermore, loss of hyaluronolytic activity leads to accumulation of hyaluronan that may be one of the steps required by the cells during carcinogenesis. All these molecules are involved in hyaluronan metabolism and in the reorganization of the extracellular matrix, in cell-extracellular matrix interactions and are likely critical factors in the development of disease. Based on the above data and the extensive studies carried out on the involvement of hyaluronan mechanisms in evolution, infiltration and metastasis of many types of cancer, the aim of this study was to study the stage-dependent expression, at transcriptional and protein level, of the molecules associated with the metabolism of hyaluronan (hyaluronan synthases, hyaluronidases, cellular receptor-CD44) in colorectal cancer. At the present study we examined the involvement of hyaluronan synthases (HAS1, HAS2, HAS3), of hyaluronidases [Hyal-1, -2, -3, PH-20, Hyal-1(V2-V5) and Hyal-3(V2-V3)] and of hyaluronan receptor (CD44s και CD44-variants) in different cancerous stages of colon cancer. We studied their expression at mRNA and protein level in macroscopically normal and cancerous tissues and in colon cancer cell lines. Expression of the molecules was confirmed by immunohistochemical analysis. During tumor progression, the actions of hyaluronan synthases and hyaluronidases lead to the production of low or high molecular mass hyaluronan molecules, each one having the ability to bind CD44 and regulate in a different way its activity. Moreover, the existence of post-translational modifications and alternative splicing of the receptor confers even greater complexity in his action. In colorectal cancer it has been shown, in vitro and in vivo, correlation between the receptor activity and the action of the metabolic enzymes of hyaluronan, where overexpression of HAS2 gene leads to faster growth of cancer cells, while overexpression of Hyal-1 gene suppresses the growth rate of cancer cells. The studies carried out in this thesis associate the overexpression of HAS2 gene with down-regulation of Hyal-1 and CD44 gene with cancer stage progression. Moreover, the loss of protein expression of Hyal-1, -2 and -3 along with the overexpression of HAS1 and HAS3 genes at initial tumor stages confers the cancerous cells hyaluronan rich environment that stimulates growth, motility and metastatic spread. Hyaluronan molecules accumulate in the matrix and lead to the formation of networks bridging CD44 molecules being expressed by cancer cells, they bind CD44 and thereby lead to signaling pathways that promote the development of colorectal cancer. Alternative splicing of the receptor gives great complexity in the above actions. The differential expression of particular alternatively spliced isoforms in the metastatic cancer cell lines, firstly confirms the alternative splicing of the receptor in cancer, and secondly relates the aggressiveness of colorectal cancer with certain isoforms (CD44v3, v7-v10, v8-v9 , v8-v10), the expression of which is affected differently by the presence or absence of serum. Knowing that growth factors and cytokines, released from the tumor cells, trigger signaling events which enhance the deposition of molecules in the extracellular space and activate the expression of CD44 by the tumor cells, it is concluded that the expression of these isoforms at high metastatic cells is favored by the presence of these factors in serum. The synthesis and degradation of different molecules of hyaluronan by their metabolic enzymes lead to interaction with the receptor, which according to the needs of cancer cells express alternatively spliced isoforms and undergo modifications in order to facilitate their actions. These processes provide extreme complexity in the behavior of the system hyaluronan synthase-hyaluronidase-hyaluronan receptor and thereby it is necessary to clarify the mechanisms that promote the metastatic phenotype of colon cancer. Finally, considering that some of these molecules have been proposed as predictors (Hyal-1, HAS1) and tumor (CD44) markers in other types of cancers, as well as complementary cancer therapies (PH-20), we propose their application in diagnosis and treatment of colon cancer.

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι από τους συνηθέστερους σε συχνότητα εμφάνισης καρκίνος παγκοσμίως. Κατά την εξέλιξή του η πρώτη διαταραχή που παρατηρείται είναι ο σχηματισμός υπερπλασίας στην επιθηλιακή επιφάνεια του εντέρου. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα να σχηματίζονται αδενώματα, τα οποία αυξάνονται σε μέγεθος και σε αριθμό, χωρίς όμως να διηθούν τις γειτονικές δομές. Ορισμένα αδενώματα μπορούν να εξελιχθούν σε καρκίνο in situ και τελικά σε διηθητικό καρκίνο. Ο εξωκυττάριος χώρος περιβάλλει τα κύτταρα και υποστηρίζει την ανάπτυξή τους εντός των ιστών. Συγκεκριμένα τα μόρια του εξωκυττάριου χώρου αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα, τα σηματοδοτούν και επηρεάζουν σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες, όπως η αναγνώριση μεταξύ των κυττάρων, η κυτταρική προσκόλληση, η μετανάστευση, ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση. Σε καρκινικές καταστάσεις λαμβάνουν χώρα δομικές αλλαγές στη σύνθεση και αποδόμηση του εξωκυττάριου χώρου, οδηγώντας σε αυξημένη εναπόθεση μορίων στο χώρο. Καθώς τα φυσιολογικά κύτταρα γίνονται καρκινικά ο εξωκυττάριος χώρος τροποποιείται και αναπλάθεται κατά τέτοιο τρόπο που προάγει την έκκριση μορίων, τα οποία ευνοούν τον περαιτέρω πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και προάγουν διεργασίες όπως είναι η διήθηση και η μετάσταση. Ο εξωκυττάριος χώρος, επομένως, είναι αυτός που παρέχει στα καρκινικά κύτταρα σήματα επιβίωσής τους, όπως ο πολλαπλασιασμός, η κινητικότητα, η διήθηση και η μετάσταση. Το υαλουρονικό είναι κύριο συστατικό του εξωκυττάριου χώρου, όπου συμμετέχει σε πληθώρα μοριακών λειτουργιών που συμβάλλουν τόσο στα δομικά χαρακτηριστικά των ιστών όσο και στην κυτταρική συμπεριφορά κατά τη διάρκεια του σχηματισμού ή της αναδιοργάνωσης των ιστών. Τα περισσότερα είδη καρκίνου χαρακτηρίζονται από αυξημένη συσσώρευση υαλουρονικού. Στις περισσότερες φυσιολογικές βιολογικές διεργασίες απαντώνται συνήθως μεγάλα μόρια υαλουρονικού, ενώ σε καρκινικές καταστάσεις συναντώνται κυρίως μικρότερα μόρια υαλουρονικού, τα οποία θεωρούνται ότι διευκολύνουν την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων και τη διήθησή τους. Στην παραγωγή μορίων υαλουρονικού καταλυτικό ρόλο παίζουν τα βιοσυνθετικά του μόρια, οι συνθάσες του υαλουρονικού (HAS1, HAS2, HAS3), και τα καταβολικά του μόρια, οι υαλουρονιδάσες (Hyal-1, -2, -3, PH-20). Οι τρεις συνθάσες, ενώ έχουν μεγάλη ομολογία στην αλληλουχία τους, διαφέρουν στα μεγέθη των μορίων υαλουρονικού που συνθέτουν. Οι υαλουρονιδάσες έχουν επίσης μεγάλη ομολογία μεταξύ τους, είναι μεταγραφικά ενεργές και η έκφρασή τους εξαρτάται από το είδος του ιστού στον οποίο εκφράζονται. Κατά την καρκινική εξέλιξη παρατηρείται διαφοροποιημένη έκφραση των συνθασών και μάλιστα η μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων τους επιτρέπει στα κύτταρα να διαμορφώνουν το εξωκυττάριο περιβάλλον έτσι ώστε να ευνοείται η καρκινική εξέλιξη και η μετάσταση. Επιπρόσθετα, έχει δειχτεί σε πληθώρα μελετών διαφοροποιημένη έκφραση των υαλουρονιδασών στον καρκίνο, κάτι το οποίο υποδηλώνει ότι τα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιούν την υαλουρονιδάση για τη διάσπαση του υαλουρονικού στους ιστούς και διευκολύνουν με τον τρόπο αυτό την καρκινική διήθηση. Επιπλέον, απώλεια της υαλουρονολυτικής δραστικότητας οδηγεί σε συσσώρευση του υαλουρονικού, όπου μπορεί να είναι ένα από τα στάδια που απαιτείται από τα κύτταρα κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης. Τα παραπάνω μόρια εμπλέκονται στο μεταβολισμό του υαλουρονικού, και έτσι στην ανάπλαση του εξωκυττάριου υλικού, στις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-εξωκυττάριου χώρου και πιθανότατα να αποτελούν κρίσιμους παράγοντες στην εξέλιξη της νόσου. Βάσει των παραπάνω δεδομένων και της εκτεταμένης μελέτης που πραγματοποιείται σχετικά με την εμπλοκή του υαλουρονικού σε μηχανισμούς εξέλιξης, διήθησης και μετάστασης πολλών ειδών καρκίνου, κρίθηκε σκόπιμη στην παρούσα διατριβή η μελέτη της σταδιο-εξαρτώμενης έκφρασης, τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο, των μορίων που σχετίζονται με το μεταβολισμό του υαλουρονικού (συνθάσες του υαλουρονικού, υαλουρονιδάσες, κυτταρικός υποδοχέας-CD44) στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η συμμετοχή των συνθασών του υαλουρονικού (HAS1, HAS2, HAS3), των υαλουρονιδασών [Hyal-1, -2, -3, PH-20, Hyal-1(V2-V5) και Hyal-3(V2-V3)] καθώς και του υποδοχέα CD44 (CD44s και CD44-variants) σε διαφορετικά στάδια εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου. Στα παραπάνω μόρια πραγματοποιήθηκε μελέτη της έκφρασής τους σε επίπεδο mRNA και σε επίπεδο πρωτεΐνης σε μακροσκοπικώς φυσιολογικούς και καρκινικούς ιστούς καθώς και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου. Η έκφραση των μορίων επιβεβαιώθηκε με ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Κατά τη διάρκεια της καρκινικής εξέλιξης, οι δράσεις των συνθασών του υαλουρονικού και των υαλουρονιδασών προσδίδουν μόρια υαλουρονικού μικρής ή μεγάλης μοριακής μάζας, καθένα από τα οποία έχει την ικανότητα να προσδένεται διαφορετικά στον CD44 και να ρυθμίζει τη δράση του. Επιπλέον, η ύπαρξη μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων και εναλλακτικού ματίσματος του υποδοχέα προσδίδει ακόμη μεγαλύτερη πολυπλοκότητα στη δράση του. Στον καρκίνο του παχέος εντέρου έχει δειχτεί, in vitro και in vivo, συσχέτιση της δράσης του υποδοχέα με τη δράση των ενζύμων μεταβολισμού του υαλουρονικού, όπου υπερέκφραση του γονιδίου της HAS2 οδηγεί σε ταχύτερο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, ενώ η υπερέκφραση του γονιδίου της Hyal-1 καταστέλλει το ρυθμό πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Οι μελέτες που πραγματοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή συνδέουν την υπερέκφραση του γονιδίου της HAS2 με τη μειορύθμιση του γονιδίου της Hyal-1 και του CD44 με την πρόοδο του καρκινικού σταδίου. Επιπλέον, η απώλεια πρωτεϊνικής έκφρασης των Hyal-1, -2 και -3 σε συνδυασμό με την υπερέκφραση των γονιδίων των HAS1 και HAS3 στα αρχικά καρκινικά στάδια προσδίδει στα καρκινικά κύτταρα πλούσιο σε υαλουρονικό περιβάλλον που ενεργοποιεί τον πολλαπλασιασμό, την κινητικότητα και τη μεταστατική εξάπλωση. Τα μόρια υαλουρονικού συσσωρεύονται στο χώρο και οδηγούν στο σχηματισμό δικτύων υαλουρονικού που γεφυρώνουν τα μόρια CD44 που εκφράζονται από τα καρκινικά κύτταρα, δεσμεύονται σε αυτόν και σηματοδοτούνται με τον τρόπο αυτό μονοπάτια που προάγουν την εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Ιδιαίτερη πολυπλοκότητα στις παραπάνω δράσεις προσδίδει το εναλλακτικό μάτισμα του υποδοχέα. Η διαφορετική έκφραση συγκεκριμένων εναλλακτικά ματισμένων μορφών του στις διαφορετικής μεταστατικότητας καρκινικές κυτταρικές σειρές, επιβεβαιώνει αφενός μεν το εναλλακτικό μάτισμα του υποδοχέα στον καρκίνο, αφετέρου δε συσχετίζει την επιθετικότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου με ορισμένες ισομορφές του (CD44v3,v7-v10, v8-v9, v8-v10), η έκφραση των οποίων επηρεάζεται διαφορετικά από την παρουσία ή μη ορού. Γνωρίζοντας ότι οι αυξητικοί παράγοντες και οι κυτταροκίνες, που απελευθερώνονται από τα καρκινικά, και όχι μόνο, κύτταρα πυροδοτούν σηματοδοτικά γεγονότα τα οποία ενισχύουν την εναπόθεση μορίων στον εξωκυττάριο χώρο και ενεργοποιούν την έκφραση του CD44 από τα καρκινικά κύτταρα, κρίνεται ότι η έκφραση των συγκεκριμένων ισομορφών στα υψηλής μεταστατικότητας κύτταρα ευνοείται από την παρουσία των παραγόντων αυτών στον ορό. Η σύνθεση και αποικοδόμηση διαφορετικών μορίων υαλουρονικού από τα ένζυμα καταβολισμού του οδηγούν σε αλληλεπίδραση με τον υποδοχέα του, ο οποίος ανάλογα με τις ανάγκες των καρκινικών κυττάρων εκφράζει ανάλογα εναλλακτικά ματισμένες μορφές του και υφίσταται τροποποιήσεις προκειμένου να διευκολύνει τις δράσεις τους. Οι παραπάνω διεργασίες προσδίδουν ιδιαίτερη πολυπλοκότητα στη συμπεριφορά του συστήματος υαλουρονικό-υαλουρονιδάση-συνθάση-υποδοχέας υαλουρονικού και έτσι κρίνεται απαραίτητη η διασαφήνιση των μηχανισμών που προάγουν το μεταστατικό φαινότυπο του καρκίνου του παχέος εντέρου. Τέλος, λαμβάνοντας υπόψη ότι ορισμένα από τα μόρια αυτά έχουν προταθεί ως προγνωστικοί (Hyal-1, HAS1) και καρκινικοί (CD44) δείκτες σε άλλα είδη καρκίνου, αλλά και ως συμπληρωματικές αντικαρκινικές θεραπείες (PH-20), πιστεύεται ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν και στον καρκίνο του παχέος εντέρου, προκειμένου να αντιμετωπιστεί η νόσος.