Μελέτη έκφρασης πρωτεϊνικών προϊόντων σε επίμυες των γονιδίων EGFR & ERBB3 που σχετίζονται με καρκινογένεση στη στοματική κοιλότητα

Abstract

Introduction: Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is a malignancy that causes significant morbidity and mortality. Cancers that develop in the oral cavity are often not detected until the later stages of the disease when treatment options are limited. The major causative factors causing OSCC is tobacco and alcohol consumption. Oral carcinogenesis is a multistep process in which genetic events lead to disruption of the normal regulatory pathways that control basic cellular functions. These genetic events include chromosomal disorders, activation of oncogenes and inactivation of tumor suppressor genes. Therefore, understanding of the molecular mechanisms involved in the onset and progression of oral cancer will help to improve the prognosis and the development of new therapies. The epidermal growth factor receptor (EGFR) belongs to the family of transmembrane receptor tyrosine kinases type I and has the ability to stimulate the protein kinase pathways Ras- Raf-MEK-ERK or PLCg-Raf-MEK-ERK after its homodimerization. EGFR can also interact with other members of the family through the formation of heterodimers. ErbB3 is a receptor for heregulin belonging to the same family of tyrosine kinases with EGFR, but lacks intrinsic tyrosine kinase activity, therefore, in order to be activated, EGFR must be associated with other ErbBs.Purpose: The purpose of the present thesis is to investigate the possible association of EGFR and ErbB3 proteins with successive histological stages of OSCC formation. The selection of these genes was based on the important role they play in cellular processes such as embryogenesis, cell proliferation, differentiation and involvement in human oncogenesis in humans generally.Materials and methods: Thirty-seven male Syrian golden hamsters were used in the present study. The animals were randomly divided into four groups: one Control group (n=7) and three experimental groups for carcinogen treatment (A, B and C; n=10 animals each). The left buccal pouches of animals were treated with 0.5% 9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene (DMBA), for 10 weeks (group A) and for 14 weeks (groups B and C). The histological status of the observed lesions in the three experimental groups correlated with tumor progression (from oral mucosal dysplasia to moderately differentiated squamous cell carcinoma). Tissue sections from normal mucosa to squamous cell carcinoma were studied, using monoclonal antibodies against the proteins. A statistical analysis was performed in each group and in each histological category.Results: A gradual progression was found, from normal mucosa to OSCC formation, compared with the increased time of application of the carcinogen, both macroscopically and microscopically. In the precancerous conditions (hyperplasia, dysplasia), a statistically significant increase in the expression of EGFR was demonstrated in comparison to normal mucosa (p <0.001). Similarly, in the statistical analysis performed between the tumour categories, a statistically significant increase was revealed in the stages of early invasion, well differentiated carcinoma and moderatelydifferentiated carcinoma in comparison to premalignant lesions (p <0.001). In addition, a statistically significant increase in EGFR expression was found in group A compared with the control group (p <0.001 ), in group B compared to group A (p <0.05), and in group B compared to group C (p <0.001). On the contrary, erbB3 or not expressed in normal or in tumor tissue.Conclusions: The experimental model of oral carcinogenesis in the buccal pouch of the Syrian golden hamsters using DMBA responds well to the gradual formation of OSCC and it may contribute to a better understanding of the mechanisms involved in the different stages of oral oncogenesis. EGFR plays a central role in carcinogenesis by the fact that it was increased from the early stages to the final stages of oral squamous cell carcinoma. Overexpression of EGFR from the early stages of cancer could be a reliable prognostic factor or serve as a target for anticancer therapy. Due to the absence of immunoreactivity of erbB3, it seems that erbB3 does not participate in signal transduction in normal or cancerous oral tissue. Possibly, another erbB factor, such as EGFR, plays a part in signal transduction.

Εισαγωγή: Το ακανθοκυτταρικό καρκίνωµα στόµατος (ΑΚΣ) είναι µια κακοήθεια που προκαλεί σηµαντική νοσηρότητα και θνησιµότητα. Οι καρκίνοι που αναπτύσσονται στη στοµατική κοιλότητα συχνά δεν ανιχνεύονται µέχρι τα προχωρηµένα στάδια της ασθένειας όταν οι θεραπευτικές επιλογές είναι περιορισµένες. Οι σηµαντικότεροι αιτιολογικοί παράγοντες πρόκλησης ΑΚΣ είναι ο καπνός και η κατανάλωση αλκοόλ. Η στοµατική καρκινογένεση είναι µια πολυσταδιακή διεργασία στην οποία γενετικά συµβάντα οδηγούν στη διαταραχή των φυσιολογικών ρυθµιστικών οδών που ελέγχουν βασικές κυτταρικές λειτουργίες. Σε αυτά τα γενετικά συµβάντα συµπεριλαµβάνονται χρωµοσωµικές διαταραχές, η ενεργοποίηση ογκογονιδίων και η απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Εποµένως, η κατανόηση των µοριακώνµηχανισµών που εµπλέκονται στην έναρξη και εξέλιξη του καρκίνου του στόµατος θα βοηθήσουν στη βελτίωση της πρόγνωσής του και την ανάπτυξη νέων µορφών θεραπείας. Ο υποδοχέας του επιδερµικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) ανήκει στην οικογένεια διαµεµβρανικών υποδοχέων τυροσινικών κινασών τύπου Ι και έχει την ικανότητα να διεγείρει τα µονοπάτια πρωτεϊνικών κινασών Ras-Raf-MEK-ERK ή PLCγ-Raf-MEK-ERK µετά από τον οµοδιµερισµό του. Ο EGFRµπορεί επίσης να αλληλεπιδράσει µε άλλα µέλη της οικογένειας µε το σχηµατισµό ετεροδιµερών. Η erbB3 είναι ένας υποδοχέας για ερεγουλίνη που ανήκει στην ίδια οικογένεια κινασών τυροσίνηςµε τον EGFR, αλλά στερείται εγγενους δράσης κινάσης τυροσίνης, εποµένως για να ενεργοποιηθεί πρέπει να συνδεθεί µε άλλες ErbB.Σκοπός: Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση της πιθανής συσχέτισης των πρωτεϊνών EGFR και ErbB3 µε διαδοχικά ιστολογικά στάδια σχηµατισµού ΑΚΣ. Η επιλογή αυτών των γονιδίων βασίστηκε στο σηµαντικό ρόλο που παίζουν σε κυτταρικές λειτουργίες, όπως είναι η εµβρυογένεση, ο κυτταρικός πολλαπλασιασµός, η διαφοροποίηση και η εµπλοκή τους στην ογκογένεση στον άνθρωπο γενικά.Υλικά και Μέθοδοι: Στη µελετη χρησιµοποιήθηκαν τριάντα-εφτά αρσενικοί Συριακοί χρυσοί επίµυες που χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις οµάδες: µία οµάδα ελέγχου (n=7) και τρεις πειραµατικές οµάδες ανάλογα µε το χρόνο εφαρµογής του καρκινογόνου (Α, Β και Γ, n=10 ζώα το καθένα). Έγιναν επαλείψεις στον αριστερό παρειακό µάρσιπο των επιµύων µε 0,5% 9,10-διµεθυλο- 1,2-βενζανθρακένιο (DMBA), για 10 εβδοµάδες (οµάδα Α), και για 14 εβδοµάδες (οµάδες Β και Γ). Η ιστολογική εικόνα των παρατηρούµενων βλαβών στις τρεις πειραµατικές οµάδες ταίριαζε µε την εξέλιξη των όγκων (από την δυσπλασία του στοµατικού βλεννογόνου έως το µέτρια διαφοροποιηµένο ακανθοκυτταρικό καρκίνωµα). Μελετήθηκαν τοµές ιστών από φυσιολογικό βλεννογόνο έως ακανθοκυτταρικό καρκίνωµα χρησιµοποιώντας µονοκλωνικά αντισώµατα έναντιτων πρωτεϊνών. Πραγµατοποιήθηκε στατιστική ανάλυση σε κάθε οµάδα και σε κάθε ιστολογικήκατηγορία.Αποτελέσµατα: ∆ιαπιστώθηκε σταδιακή πορεία εξέλιξης των βλαβών από το φυσιολογικό βλεννογόνο µέχρι το σχηµατισµό ΑΚΣ σε σχέση µε τον αυξηµένο χρόνο εφαρµογής του καρκινογόνου τόσο µακροσκοπικά όσο και µικροσκοπικά. Στις προκαρκινικές καταστάσεις (υπερπλασία, δυσπλασία) παρατηρήθηκε στατιστικά σηµαντική αύξηση του ποσοστού έκφρασης του EGFR, σε σύγκριση µε το φυσιολογικό βλεννογόνο (p<0.001). Παροµοίως, στη στατιστική ανάλυση µεταξύ των κατηγοριών του όγκου, αποκαλύφθηκε στατιστικά σηµαντική αύξηση στα στάδια πρώιµης διήθησης, καλά διαφοροποιηµένου καρκινώµατος και µέτρια διαφοροποιηµένου καρκινώµατος σε σύγκριση µε τις προκαρκινικές βλάβες (p<0.001). Επιπροσθέτως, παρατηρήθηκε στατιστικά σηµαντική αύξηση στην έκφραση του EGFR στην οµάδα Α σε σύγκριση µε την οµάδα ελέγχου (p<0.001), στην οµάδα Β σε σύγκριση µε την οµάδα Α (p<0.05), και στην οµάδα Β σε σύγκριση µε την οµάδα Γ (p<0.001). Αντιθέτως, το erbB3 δεν εκφράσθηκε ούτε σε φυσιολογικό ούτε σε καρκινικό ιστό.Συµπεράσµατα: Το πειραµατικό µοντέλο στοµατικής ογκογένεσης στον παρειακό µάρσιπο των Συριακών χρυσών επιµυών µε τη χρήση DMBA ανταποκρίνεται καλώς στο σταδιακό σχηµατισµό ΑΚΣ και µπορεί να συµβάλει στην καλύτερη κατανόηση των µηχανισµών που εµπλέκονται στα διάφορα στάδια ογκογένεσης στη στοµατική κοιλότητα. Ο EGFR κατέχει κεντρικό ρόλο στη διαδικασία της καρκινογένεσης βάσει του γεγονότος ότι βρέθηκε αυξηµένος από τα πρώιµα στάδια έως και τα τελικά στάδια του ακανθοκυτταρικού καρκινώµατος στο στόµα. Η υπερέκφραση του EGFR από τα πρώιµα στάδια του καρκίνου θα µπορούσε να αποτελέσει έναν αξιόπιστο προγνωστικό δείκτη ή να εξυπηρετήσει ως στόχος για αντικαρκινική θεραπεία. Λόγω της απουσίας ανοσοαντιδραστικότητας του erbB3, φαίνεται ότι το erbB3 δεν συµµετέχει στη µεταγωγή σήµατος σε φυσιολογικό ή καρκινικό στοµατικό ιστό. Ενδεχοµένως, κάποιος άλλος παράγοντας erbB, όπως ο EGFR, παίζει ρόλο στη µεταγωγή σήµατος.