Χαρτογράφηση της μικροαρχιτεκτονικής των οστών με τη μεθοδολογία της υλικογραφίας

Abstract

Aim: The development of a simplified technique for the large scale study of bone microstructure on undefalcified bone (mineral bone histomorphometry). Established techniques such as undecalcified bone thin sectioning, ultrathin grinding, surface-stained block-grindings and micro-CT, electron microscopy, are expensive, time consuming, have very high demands on equipment, consumables, laboratory safety facilities and personell expertise.Method: The proposed technique is based on the principles of materiallography. However, its novelty lies on the selection of user-friendly, low-cost equipment and materials in all stages of preparation (cutting, defatting, embedding, grinding, staining, digitization). On the present thesis, all stages are described in detail, with many practical tips for the successful implementation: parallel thin cutting with a modified table band-saw arrangment, defatting with sodium hypochloride (bleach), embedding in epoxy-resin, silicon-carbide paper grinding, von Kossa staining, flatbed scanner digitization. For the purposes of an integrated research project, the open-source plugin “Map_BoneMicrostructure” was developed for the platform ImageJ, for image processing and acquisition of quantitative results.For the validation of the method, eight bone specimens were studied with the established technique of microCT, and subsequently with the rapid metariallographic method. The bone histomorphometry parameters BV/TV, Tb.Th., Tb.Sp., Tb.N. were calculated by each method, and were subjected to the statistical test of Pearson’s linear correlation. The correlation was found statistical significant (p<0,005) for all four parameters.Discussion: The proposed technique is not microscope-bound, can be implemented even on large specimens, is relatively quick, uses safe materials, and has low demands on laboratory equipment (aprox. 1000€) and consumables (aprox. 5€ pro slice). However, it is not suitable for the study of cellular structures. It was successfully validated compared with the established microCT.Conclusion: The rapid materiallographic method is an integrated research tool, and has all prerequisites to contribute to the expansion of the study of bone tissue, since it allows the rapid study of bone samples with low equipment and consumables costs.

Στόχος: Η ανάπτυξη μιας απλοποιημένης τεχνικής για τη μελέτη της οστικής μικροαρχιτεκτονικής σε μη αφαλατωμένα δείγματα μεγάλης κλίμακας (οστική ιστομορφομετρία). Οι έως τώρα καθιερωμένες τεχνικές, όπως μη αφαλατωμένες λεπτοτομές, υπέρλεπτη λείανση, επιφανειακή χρώση λειασμένων δοκιμίων, microCΤ, ηλεκτρονιακή μικροσκόπηση, είναι κατά κανόνα δαπανηρές, χρονοβόρες, θέτουν υψηλές απαιτήσεις σε εξοπλισμό, αναλώσιμα, μέτρα εργαστηριακής ασφάλειας και εξειδίκευση προσωπικού.Μέθοδος: Η τεχνική στηρίζεται στις αρχές της υλικογραφίας, ωστόσο η πρωτοπορία της έγκειται στην επιλογή εύχρηστου και χαμηλού κόστους εξοπλισμού και αναλώσιμων σε όλα τα στάδια της επεξεργασίας (κοπή, απολίπανση, εγκιβωτισμός, λείανση, χρώση, ψηφιοποίηση). Στην παρούσα διατριβή περιγράφονται διεξοδικά τα στάδια επεξεργασίας, καθώς και πλήθος τεχνικών λεπτομερειών για την επιτυχή πρακτική εφαρμογή τους: κοπή λεπτών παράλληλων τομών με τη βοήθεια ιδιοδιάταξης επί επιτραπέζιας πριονοκορδέλλας, καθαρισμός λίπους σε υποχλωρίδιο το νατρίου (χλωρίνη), εγκιβωτισμός σε εποξεική ρητίνη, λείανση με λειαντικά χαρτιά καρβίδιου του πυριτίδου, χρώση με τροποποιημένη τεχνική von Kossa, ψηφιοποίηση σε επιτραπέζιο σαρωτή. Στα πλαίσια μιας ολοκληρωμένης ερευνητικής πρότασης, αναπτύχθηκε το πρόσθετο Map_BoneMicrostructure ως λογισμικό ελεύθερου κώδικα για την πλατφόρμα ImageJ για την επεξεργασία των εικόνων και την εξαγωγή ποσοτικών μετρήσεων.Για την επικύρωση της μεθόδου, οχτώ οστικά δείγματα μελετήθηκαν με την καθιερωμένη τεχνική της microCT, και εν συνεχεία υπεβλήθησαν στην ταχεία υλικογραφική μέθοδο. Οι παράμετροι οστικής ιστομορφομετρίας BV/TV, Tb.Th., Tb.Sp., Tb.N. υπολογίστηκαν για κάθε δείγμα και με τις δύο μεθόδους, και εν συνεχεία υπεβλήθησαν στη στατιστική δοκιμασία του συντελεστή γραμμικής συσχέτισης Pearson. Η συσχέτιση ήταν στατιστικά σημαντική (p<0,005) και για τις τέσσερις παραμέτρους.Συζήτηση: Η προτεινόμενη τεχνική δεν εξαρτάται από μικροσκόπηση, μπορεί να εφαρμοστεί σε μεγάλα δείγματα, είναι σχετικά ταχεία, χρησιμοποιεί ασφαλή υλικά, και έχει ελάχιστες απαιτήσεις σε εργαστηριακό εξοπλισμό (περ. 1000€) και αναλώσιμα (περ. 5€ ανά διατομή). Ωστόσο, δεν επιτρέπει τη μελέτη κυτταρικών στοιχείων. Η μέθοδος επικυρώθηκε επιτυχώς συγκρινόμενη με τη microCT.Συμπέρασμα: Η ταχεία υλικογραφική μέθοδος είναι ένα ολοκληρωμένο ερευνητικό εργαλείο, και έχει τις προϋποθέσεις να συμβάλλει στην επέκταση της μελέτης του οστίτη ιστού, καθώς επιτρέπει την ταχεία μελέτη οστικών δειγμάτων με χαμηλές απαιτήσεις εξοπλισμού και κόστος αναλώσιμων.