Μελέτη της σχέσης της οδού των νευροπεπτιδίων με την οδό ουβικουϊτίνης – πρωτεασώματος στο πολλαπλό μυέλωμα

Abstract

Purpose Bortezomib (BTZ) is used for the treatment of multiple myeloma (MM). However, a significant proportion of patients may be refractory to the drug. This study aimed to investigate whether the endothelin (ET-1) axis may act as an escape mechanism to treatment with bortezomib in MM cells.Methods NCI-H929 and RPMI-8226 (human MM cell lines) were cultured with or without ET-1, BTZ, and inhibitors of the endothelin receptors. ET-1 levels were determined by ELISA, while the protein levels of its receptors and of the PI3K and MAPK pathways’ components bywestern blot. Effects of ET-1 on cell proliferation were studied by MTT and on the ubiquitin proteasome pathway by assessing the chymotryptic activity of the 20S proteasome in cell lysates.Results Endothelin receptors A and B (ETAR and ETBR, respectively) were found to be expressed in both cell lines, with the RPMI-8226 cells that are considered resistant to BTZ, expressing higher levels of ETBR and in addition secreting ET-1. Treatment of the NCI-H929 cells with ET-1 increased proliferation, while co-incubation of these cells with ET-1 and BTZ decreased BTZ efficacy with concomitant upregulation of 20S proteasomal activity. Si- RNA silencing or chemical blockade of ETBR abrogated the protective effects of ET-1. Finally, data suggest that the predominant signaling pathway involved in ET-1/ETBRinduced BTZ resistance in MM cells may be the MAPK pathway.Conclusion Our data suggest a possible role of the ET-1/ ETBR axis in regulating the sensitivity of MM cells to BTZ. Thus, combining bortezomib with strategies to target the ET-1 axis could prove to be a novel promising therapeutic approach in MM.

Σκοπός Το bortezomib γνωστό με το κωδικό όνομα PS-341 και το εμπορικό όνομα VELCADE είναι ο πρώτος σε κλινική εφαρμογή αναστολέας πρωτεασώματος που εγκρίθηκε το Μάιο του 2003 από τον Αμερικανικό Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) για τη θεραπεία του επιδεινούμενου και υποτροπιάζοντος πολλαπλού μυελώματος (ΜΜ), σε ασθενείς οι οποίοι έχουν ήδη υποβληθεί τουλάχιστον μία φορά σε θεραπεία και του λεμφώματος μανδύα. Παρόλα αυτά, η ανθεκτικότητά του συνεχίζει να παραμένει ένα κλινικά σημαντικό πρόβλημα, καθώς ένα σημαντικό ποσοστό των ασθενών δεν καταφέρνει να έχει ανταπόκριση στη θεραπεία και η πλειοψηφία αυτών που ανταποκρίνεται τελικά υποτροπιάζει. Αντικείμενο της παρούσας έρευνας είναι η διερεύνηση του ρόλου του άξονα της ΕΤ-1 ως ένας πιθανός μηχανισμός διαφυγής στη θεραπεία με το ΒΤΖ στα ΠΜ κύτταρα. Υλικά & Μέθοδοι Οι ανθρώπινες ΠΜ καρκινικές κυτταρικές NCI-H929 και RPMI-8226 καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία των ΕΤ-1, ΒΤΖ και ανταγωνιστών των υποδοχέων της ΕΤ-1. Τα επίπεδα της ΕΤ-1 εκτιμήθηκαν με ELISA, ενώ τα πρωτεϊνικά επίπεδα των υποδοχέων της ΕΤ-1 και των μορίων-τελεστών των μονοπατιών MAPK και PI3K/Akt/mTOR με ανάλυση Western blot. Oι δράσεις της ΕΤ-1 στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό εκτιμήθηκαν με MTT Assay, ενώ στο μονοπάτι UPS μετρώντας την δράση χυμοτρυψίνης του 20S πρωτεασώματος στα κυτταρικά λύματα.Αποτελέσματα Οι υποδοχείς της ΕΤ-1 (ΕΤΑR και ETBR) βρέθηκε να εκφράζονται και στις 2 ΠΜ κυτταρικές σειρές, με την RPMI-8226 κυτταρική σειρά η οποία θεωρείται ανθεκτική στο ΒΤΖ, να εκφράζει υψηλότερα επίπεδα ETBR και να εκκρίνει/παράγει υψηλότερα επίπεδα ΕΤ-1. Επώαση των NCI-H929 κυττάρων με την ΕΤ-1 βρέθηκε να επάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, ενώ συνεπώαση με ΕΤ-1 και ΒΤΖ μείωσε την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου με ταυτόχρονη αυξορύθμιση της 20S πρωτεασωμικής δραστικότητας. Αποσιώπηση με siRNA ή παρεμπόδιση με πεπτιδικούς ανταγωνιστές του υποδοχέα ETBR ανέστειλε τις προστατευτικές δράσεις της ΕΤ-1. Επίσης, τα δεδομένα προτείνουν ότι το MAPK μονοπάτι ίσως συνιστά το κυριότερο μονοπάτι που εμπλέκεται στην ET-1/ETBR επαγόμενη ανθεκτικότητα στο ΒΤΖ στα ΠΜ κύτταρα.Συμπεράσματα Τα δεδομένα μας προτείνουν έναν πιθανό ρόλο του άξονα ET-1/ETBR στην ρύθμιση της ευαισθησίας των ΠΜ κυττάρων στο ΒΤΖ. Συνδυασμός του ΒΤΖ με στρατηγικές που στοχεύουν στον άξονα της ΕΤ-1, μπορεί να αποτελέσει μία καινοτόμα πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση στο ΠΜ.