Ο ρόλος της αυτοφαγίας και της λυσοσωμικής βιογένεσης στην ανταπόκριση των γλοιοβλαστωμάτων στην ακτινοθεραπεία

Abstract

Glioblastoma is the most common cancer of Central Nervous System and one of the most aggressive human tumors. The median survival of patients is 12 months, while most of the patients pass away within 2 years since diagnosis. The standard treatment protocol includes surgical resection followed by radiotherapy and chemotherapy. Temozolomide is the only chemotherapy agent shown to increase the median survival by 2,6 months, when combined with radiation. Unfortunately, despite the increase of successful treatment rates in various types of human cancer, the median survival in glioblastoma remains poor.The recognized feature of glioblastoma to be resistant to apoptotic stimuli led the scientists to study alternative cell death pathways in order to increase the efficacy of existing treatment methods. A variety of cell pathways may play a role not only in the detection of endogenous differences between normal and cancer cells, but also to understanding how the radiotherapy and chemotherapy affect these procedures.During the last decade many research studies focused on a cell death/survival pathway, namely autophagy. Autophagy constitutes a complicated cell pathway, which supports cell survival under stressful conditions, sustaining the energy balance. The term autophagy includes three different mechanism, macroautophagy, microautophagy and chaperon-mediated autophagy although 'autophagy' is commonly used to describe macroautophagy. During macrοautophagy cytoplasmic components are engulfed by vesicles called autophagosomes and degraded after the fusion of autophagosomes with lysosomes, which contain a variety of proteolytic enzymes. This degradation leads to the recycling of cytoplasmic organelles and molecules.Several studies have focused on the effect of autophagy on the radiotherapy and temozolomide activity in cancer cells. These attempts have provided conflicting results, as some studies suggest that inhibition of autophagy sensitizes cancer cells to radiotherapy and chemotherapy, while others found sensitization following enhancement of autophagy. This paradox reflects the complexity of autophagic pathway and may be related to different patterns of autophagic death.In the current study we investigated the autophagic pathway activity in normal brain and glioblastoma and the effect of radiation on this procedure. Moreover, we studied an eventual sensitization of glioblastoma to radiation and chemotherapy (in vitro and in vivo), by interfering the autophagic pathway.Firstly, using Western blot analysis and immunohistochemistry, we exhibited that there are different expression patterns of autophagic and lysosomal markers between normal brain and glioblastoma. The rate of autophagic flux was higher in glioblastoma cells and tissues as specific structures, called Stone-Like Structure, were observed, eventually as a result of intense autophagic flux and lysosomal exhaustion. Of interest, a direct association between SLS and poor prognosis of glioblastoma patients treated with radiotherapy was confirmed. Furthermore, statistical analysis of immunohistochemistry results showed an association between expression of TFEB with autophagic markers, LC3A and LC3B, and HIF1α. The study of association of Cathepsin D with the same markers exhibited similar results. On the other hand, expression levels of oncogene PTEN were associated with expression levels of LC3B, but not LC3A. These findings supports the different biological role of LC3s.We thereafter performed experiments to identify the localization and kinetics of the three LC3 proteins (A, B and C), in glioblastoma cells. The absence of colocalization between LC3A and LC3B, in the cytoplasm and in the nuclei, supports the distinct role of these two types of autophagosomes. Of interest, LC3A resides in the perinuclear area and nuclei, while LC3B, although distributed throughout the cytoplasm, it localizes in the nucleolar region in the nuclei. An additional interesting finding was the way of LC3s enter the nuclei, using importin a/b, while they leave the nuclei using CRM1/exportin pathway. Colocalization between Beclin 1/LC3A suggested that Beclin 1, may show that Beclin 1 is involved in LC3 nuclear/cytoplasm kinetics, though complex formation with LC3s.Different expression pattern of autophagic and lysosomal markers were observed, not only between normal brain and glioblastoma cells, but between the two different glioblastoma cell lines. Except from endogenous differences between two types of glioblastoma cell lines, the expression levels of these markers were different after radiation, as well. In U87MG cell line radiation inhibits the autophagic flux two days after treatment, while enhances the flux in the T98G cell line.The inhibition of autophagic flux in U87MG cell line may be the reason for the increase radiosenstivity this cell line, as DNA damage (assessed with the γΗ2ΑΧ nuclear foci formation assay) did not differ between the two cell lines. By silencing either of MAP1LC3s or TFEB an important radiosensitization was noted in both glioblastoma cell lines. The radiosensitization activity of autophagy suppression was further confirmed by using in vivo experiments. Finally, the silencing of autophagic flux increased the cytotoxic effect of temozolomide, as well.Taking all the aforementioned into consideration, we conclude that the function of the autophagic machinery is associated with cell survival under stressful conditions and with radio- and chemoresistance of glioblastoma. We suggest that autophagy may function as a prognostic factor for glioblastoma patients undergoing radiotherapy. Moreover, we propose that the specific inhibition of autophagic flux may contribute to the development of radio- and chemosensitization policies aiming to improve the devastating survival figures of glioblastoma patients.

Το γλοιοβλάστωμα αποτελεί τον πιο συχνό τύπο καρκίνου του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος και έναν από τους πιο επιθετικούς τύπους καρκίνου που παρατηρούνται στον άνθρωπο. Η μέση επιβίωση των ασθενών με γλοιοβλάστωμα δεν ξεπερνά τους 12 μήνες ενώ σε κάποιες περιπτώσεις υπάρχουν ασθενείς που επιβιώνουν μέχρι και 2 έτη. Το κλασικό θεραπευτικό πρωτόκολλο περιλαμβάνει, αρχικά τη χειρουργική αφαίρεση του όγκου και στη συνέχεια την εφαρμογή ακτινοθεραπείας και χημειοθεραπείας. Ο μοναδικός χημειοθεραπευτικός παράγοντας που έχει αποδειχθεί αποτελεσματικός είναι η τεμοζολομίδη, αυξάνοντας τη μέση επιβίωση κατά 2,6 μήνες. Παρά τις προόδους που έχουν επιτελεστεί στον τομέα της θεραπείας του καρκίνου, η αύξηση της μέσης επιβίωσης δεν είναι ανάλογη στους ασθενείς με γλοιοβλάστωμα. Η ιδιαιτερότητα που εμφανίζει το γλοιοβλάστωμα εξαιτίας τόσο της φύσης του εγκεφάλου όσο και της απουσίας απόπτωσης από τα κύτταρα του γλοιοβλαστώματος έχουν εγείρει το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας η οποία έχει πλέον στραφεί στη διερεύνηση διαφορετικών μονοπατιών με σκοπό την αύξηση της ευαισθησίας του γλοιοβλαστώματος στις υπάρχουσες θεραπευτικές μεθόδους. Η μελέτη των διαφόρων ενδοκυττάριων μονοπατιών αποτελεί το κλειδί όχι μόνο στην κατανόηση των ενδογενών διαφορών που εμφανίζουν τα καρκινικά κύτταρα έναντι των φυσιολογικών κυττάρων αλλά και τον τρόπο με τον οποίο επιδρούν σε αυτά τόσο η ακτινοθεραπεία όσο και χημειοθεραπεία.Τις τελευταίες δεκαετίες διάφορες μελέτες στράφηκαν σε μία εξαιρετικά σημαντική ενδοκυττάρια διαδικασία, την αυτοφαγία. Η αυτοφαγία αποτελεί ένα ιδιαιτέρως πολύπλοκο ενδοκυττάριο μονοπάτι το οποίο συμβάλλει αποτελεσματικά στη διατήρηση του ενεργειακού ισοζυγίου άρα και στην επιβίωση των κυττάρων που βρίσκονται σε δυσμενές για αυτά περιβάλλον. Αν και ο όρος αυτοφαγία περιλαμβάνει τρεις διαφορετικούς μηχανισμούς, την μακρο-αυτοφαγία, την μικρο-αυτοφαγία και την διαμεσολαβούμενη από σαπερόνες αυτοφαγία, ο όρος χρησιμοποιείται κυρίως για να περιγράψει την μακρο-αυτοφαγία. Η μακρο-αυτοφαγία αποτελεί μία διαδικασία κατά την οποία τα προς αποικοδόμηση κυτταροπλασματικά προϊόντα εγκολπώνονται σε κυστίδια που ονομάζονται αυτοφαγοσώματα και αποικοδομούνται μετά τη σύντηξη αυτών των κυστιδίων με τα λυσοσώματα τα οποία περιέχουν πρωτεολυτικά ένζυμα. Η αποικοδόμηση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την ανακύκλωση των κυτταροπλασματικών προϊόντων.Διάφορες μελέτες συσχέτισαν την ακτινοβολία και την χημειοθεραπεία με τεμοζολομίδη με την αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα παρέχοντας στις περισσότερες περιπτώσεις διφορούμενα αποτελέσματα καθώς σε ορισμένες από αυτές η καταστολή προκάλεσε την ευαισθητοποίηση των καρκινικών κυττάρων στην ακτινοβολία ή τη χημειοθεραπεία ενώ σε άλλες η ενίσχυση της αυτοφαγικής ροής είχε το ίδιο αποτέλεσμα. Τα διφορούμενα αυτά αποτελέσματα αντανακλούν την πολυπλοκότητα του μονοπατιού και πιθανόν σχετίζονται με την ανάπτυξη διαφορετικών τύπων αυτοφαγικού θανάτου στο κύτταρο.Στην παρούσα μελέτη έγινε προσπάθεια πλήρους κατανόησης του αυτοφαγικού μονοπατιού τόσο σε φυσιολογικούς ιστούς και κύτταρα όσο και σε ιστούς και κύτταρα γλοιοβλαστώματος καθώς και της επίδραση σε αυτό των κύριων θεραπευτικών μεθόδων. Στη συνέχεια στόχος ήταν η εκμετάλλευση της παραπάνω γνώσης με απώτερο σκοπό την επίδραση στο αυτοφαγικό μονοπάτι και την ανάπτυξη ακτινευαισθησίας και χημειοευαισθησίας in vitro και in vivo.Τα πρώτα δεδομένα που εξήχθησαν έδειξαν μεγάλες διαφορές στο αυτοφαγικό και λυσοσωμικό πρότυπο ανάμεσα στο φυσιολογικό εγκέφαλο και στα κύτταρα του γλοιοβλαστώματος κάτι που παρατηρήθηκε και μετά από ανοσοϊστοχημική εξέταση σε ιστούς ασθενών με γλοιοβλάστωμα. Συγκεκριμένα, η ένταση της αυτοφαγικής ροής είναι πολύ υψηλότερη στα κύτταρα και τους ιστούς των γλοιοβλαστωμάτων, κάτι που διαπιστώνεται από την παρουσία ειδικών δομών, Stone-Like Structures, οι οποίες είναι αποτέλεσμα της έντονης κατανάλωσης αυτοφαγοσωμάτων και εξάντλησης του λυσοσωμιακού δυναμικού. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η συσχέτιση της παρουσίας αυτών των δομών με κακή πρόγνωση της νόσου.Η ανάλυση των δεδομένων μετά την ανοσοϊστοχημική μελέτη έδειξε μία φανερή συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα TFEB και στους αυτοφαγικούς δείκτες, LC3A και LC3B, καθώς και σχέση της έκφρασης του με τον παράγοντα HIF1α. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα της συσχέτισης της έκφρασης της Cathepsin D με τους ίδιους παράγοντες. Αντίθετα, η έκφραση του ογκογονιδίου PTEN συσχετίστηκε μόνο με την LC3Β, υποστηρίζοντας την ύπαρξη διαφορετικών βιολογικών ρόλων ανάμεσα στις διαφορετικές ισομορφές της LC3.Η μελέτη του εντοπισμού των LC3s στο εσωτερικό του κυττάρου και παρατήρηση διαφορετικού εντοπισμού τόσο στο κυτταρόπλασμα όσο και στον πυρήνα ενίσχυσε αυτή την άποψη. Επιπλέον, η ταυτοποίηση του τρόπου εισόδου μέσω του μονοπατιού των importin a/b καθώς και εξόδου μέσω του μονοπατιού CRM1/exportin, αποτελεί μία εξαιρετικά ενδιαφέρουσα παρατήρηση και σε συνδυασμό με τον καθολικό συνεντοπισμό της LC3A με την Beclin 1 πιθανόν υποδηλώνει ότι η Beclin 1 αποτελεί μέρος ενός συμπλόκου εισόδου των LC3s.Εκτός των παραπάνω, διαφορές παρατηρήθηκαν στα πρότυπα έκφρασης αυτοφαγικών και λυσοσωμικών δεικτών ανάμεσα στα διαφορετικά είδη κυττάρων γλοιοβλαστώματος που χρησιμοποιήθηκαν. Πέραν των ενδογενών διαφορών των δύο ειδών κυττάρων διαφορετική ήταν και η αντίδραση τους μετά την ακτινοβόληση καθώς στα κύτταρα γλοιοβλαστώματος U87MG εμφανίστηκε καταστολή της αυτοφαγίας δύο ημέρες μετά την ακτινοβολία, ενώ στα κύτταρα γλοιοβλαστώματος T98G παρατηρήθηκε ενεργοποίηση της. Οι διαφορές αυτές αποτελούν πιθανή αιτία της μεγαλύτερης ευαισθησίας των κυττάρων U87MG στην ακτινοβολία. Η συγκεκριμένη πρόταση ενισχύθηκε καθώς η καταστολή της αυτοφαγίας με siRNA, είτε έναντι των ΜΑP1LC3s είτε του γονιδίου που εκφράζει τον μεταγραφικό παράγοντα TFEB, μείωσε τη δόση ακτινοβολίας που προκαλεί 50% κυτταρικό θάνατο και των δύο κυτταρικών σειρών γλοιοβλαστώματος επηρεάζοντας περισσότερο τα κύτταρα T98G. Η αύξηση της ευαισθησίας επιβεβαιώθηκε επίσης και σε in vivo μοντέλα. Τέλος, η καταστολή της αυτοφαγικής ροής με τους τρόπους που αναφέρθηκαν διαπιστώθηκε πως αυξάνει το κυτταροτοξικό αποτέλεσμα της τεμοζολομίδης. Ανακεφαλαιώνοντας, συμπεραίνουμε πως η αυτοφαγία σχετίζεται άμεσα με την επιβίωση του κυττάρου σε δυσμενείς συνθήκες καθώς και με την αντοχή που εμφανίζουν τα γλοιοβλαστώματα στην ακτινοθεραπεία και τη χημειοθεραπεία με τεμοζολομίδη. Η ποσοτικοποίηση της αυτοφαγίας, θα μπορούσε λοιπόν να αποτελέσει προγνωστικό δείκτη της εξέλιξης της νόσου του γλοιοβλαστώματος, ενώ η ειδική καταστολή της θα μπορούσε να συμβάλλει στην ανάπτυξη ακτινευαισθησίας και χημειοευαισθησίας με επακόλουθη αύξηση της επιβίωσης των ασθενών.