Απομόνωση καλλιέργεια και χαρακτηρισμός υποπληθυσμών μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από διάφορες πηγές από τον άνθρωπο και το ποντίκι

Abstract

During the course of this study we focused on:The thorough characterization of the bone marrow Mesenchymal Stem Cells MSC (BM-MSC) population derived from the BALB/c species, considering the significance of the murine model amongst animal models. Specifically, we examined the effect of gender, age, and in vitro culture on the basic properties (proliferation, differentiation, and immunosuppressive potential) of mouse BM-MSC (mBM-MSC); and found a decline of the progenitor frequencies in the BM with age, lower MSC frequencies in all female donors, and an increase in the mBM-MSC proliferation rate upon in vitro propagation. We also examined mBM-MSC for the expression of the 3 major embryonic stem cell transcription factors, Oct3/4, Sox-2, and Nanog, as well as 2 mRNA binding proteins, Coding Region Determinant Binding Protein/Insulin-Like Growth Factor 2 mRNA Binding Protein 1 (Crd-bp/Imp1) and Deleted in Azoospermia-Like (Dazl), which are expressed in umbilical cord blood hematopoietic stem cells and amniotic fluid stem cells, respectively. We report, for the first time, the expression of Crdbp/Imp1 and Dazl in mBM-MSC. Dazl, Oct3/4, and Sox2 were detected in relatively low levels in contrast to Crd-bp/Imp1, its major target c-Myc, as well as Nanog, which were expressed redundantly, irrespective of sex, donor age, or in vitro passaging.Determining the effect of intravenous administration of young mBM-MSC to elderly mice in the alleviation of the aging phenotype in a preclinical mouse model, as aging has been recently linked to stem cell exhaustion. Here we show the positive outcome of this administration: a) on organismal characteristics linked to aging, such as prevention of musculoskeletal degeneration, cutaneous atrophy, inflammatory diseases etc. and b) on the mBM-MSC population itself. The data presented herein along with data from the first part of this study strengthen the notion that the cells possess the ability to proliferate indefinitely if the necessary signals are provided.The expression of CRD-BP/IMP1 in different MSC populations of human origin, specifically BM-MSC, adipose tissue (AT), and umbilical cord (UC). Here we demonstrate for the first time that MSC have a differential pattern of CRD-BP/IMP-1 expression that could correlate with their proliferation rate. UC- MSC with higher proliferation rate also express CRD-BP/IMP1 at higher levels, and gene knocking down resulted in significant reduction of cell proliferation and in vitro self renewal. Members of the TET family of demethylases are involved in the epigenetic regulation of CRD-BP/IMP-1 in human MSC. Finally, TET1, TET2, CRD-BP/IMP1 along with c-MYC are pivotal parts of a complex network involved in the regulation of MSC proliferative capacity.

Κατά τη διάρκεια αυτής της εργασίας εστιάσαμε :Στον διεξοδικό χαρακτηρισμό των Μεσεγχυματικών Βλαστικών Κυττάρων (MSC) από το μυελό των οστών BALB/c ποντικών (mBM-MSC), λαμβάνοντας υπόψη τη σημασία του μοντέλου αυτού ανάμεσα στα ζωικά μοντέλα. Συγκεκριμένα, εξετάστηκε πως επηρεάζει το φύλο και η ηλικία του δότη τις βασικές ιδιότητες (πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση και ανοσοκατασταλτική δράση) των mBM-MSC. Παρατηρήθηκε, μείωση της συχνότητας των προγονικών κυττάρων στο BM με την ηλικία και χαμηλότερες συχνότητες MSC σε όλους τους θηλυκούς δότες ανεξαρτήτως ηλικίας. Η εκτενής καλλιέργεια τους, προκάλεσε αύξηση του ρυθμoύ διπλασιασμού, μείωση του μεγέθους και της πολυπλοκότητας των κυττάρων. Επιπλέον, τα mBM-MSC εξετάστηκαν για την έκφραση των τριών πιο σημαντικών μεταγραφικών παραγόντων των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων (ESC): Oct3/4, Sox-2, και Nanog, καθώς και για την έκφραση δυο mRNA δεσμευτικών πρωτεϊνών της Crd-bp/Imp1 και της Dazl, οι οποίες εκφράζονται στα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα του ομφαλιοπλακουντικού αίματος (UCB-CD34+-HSC) και στα βλαστικά κύτταρα του αμνιακού υγρού, αντίστοιχα. Αναφέρουμε, για πρώτη φορά, την έκφραση της Crdbp/Imp1 και της Dazl στον mBM-MSC πληθυσμό. Η έκφραση του Dazl, Oct3/4, και Sox2 ανιχνεύθηκε σε σχετικά χαμηλά επίπεδα, σε αντίθεση με αυτήν των Crd-bp/Imp1, c-Μyc (τον πιο σημαντικό στόχο της Crd-bp/Imp1) και Nanog, που εκφράζονταν σε υψηλά επίπεδα, ανεξάρτητα από το φύλο και την ηλικία του δότη, ή την in vitro καλλιέργεια.Στον προσδιορισμό της επίδρασης της ενδοφλέβιας χορήγησης νεαρών mBM-MSC σε ηλικιωμένα ποντίκια για την καταπράυνση του φαινοτύπου της γήρανσης μιας και. μελέτες των τελευταίων χρόνων έχουν συνδέσει την γήρανση με την εξάντληση της αποθήκης των βλαστοκυττάρων. Εδώ δείχνουμε για πρώτη φορά την θετική έκβαση αυτής της χορήγησης, πιθανά μέσω παρακρινούς δράσης: α) στον οργανισμό σαν σύνολο (πρόληψη μυοσκελετικού εκφυλισμού, δερματικής ατροφίας, μείωση φλεγμονώδους απόκρισης κλπ.) και β) στον ίδιο τον mBM-MSC πληθυσμό.Συνεπώς, το πιλοτικό αυτό προκλινικό μοντέλο καθώς και τα δεδομένα από το πρώτο μέρος της μελέτης ενισχύουν την αντίληψη ότι τα βλαστοκύτταρα έχουν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται επ 'αόριστον εάν παρέχονται τα απαραίτητα σήματα. Στην έκφραση του CRD-BP/IMP1 στους διαφορετικούς πληθυσμούς MSC ανθρώπινης προέλευσης, συγκεκριμένα BM-MSC, ΑΤ-MSC (λιπώδους ιστού) και UC-MSC (ομφάλιου λώρου). Εδώ δείχνουμε για πρώτη φορά ότι αυτά τα MSC έχουν ένα μοτίβο διαφορικής έκφρασης του CRD-BP/IMP-1 που μπορεί να συσχετιστεί με τον ρυθμό πολλαπλασιασμού τους. Τα UC-MSC που έχουν υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού εκφράζουν επίσης CRD-BP/IMP1 σε υψηλότερα επίπεδα. Μετά από πειράματα επιλεκτικής παρεμπόδισης της έκφρασης του CRD-BP/IMP1 παρατηρήθηκε σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και της in vitro αυτοανανέωσης τους. Επιπλέον επιβεβαιώνεται πως η έκφραση της CRD-BP/IMP1 βρίσκεται υπό επιγενετικό έλεγχο και μέλη της οικογένειας των ΤΕΤ απομεθυλασών εμπλέκονται στην ρύθμιση της στα ανθρώπινα MSC. Ειδικότερα το TET1, TET2, CRD-BP/IMP1 μαζί με το c-Μyc αποτελούν αναπόσπαστα κομμάτια ενός πολύπλοκου δικτύου που συμμετέχουν στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των MSC.