Μελέτη των ειδικών έναντι του κυτταρομεγαλοϊού κυτταροτοξικών (CD8+) λεμφοκυττάρων, μετά απο αλλογενή μεταμόσχευση αρχεγόνων αιμοποιητικών κυττάρων σε παιδιατρικούς ασθενείς, και διερεύνηση του ρόλου τους στην κλινική πράξη

Abstract

Cytomegalovirus (CMV) is a ubiquitous pathogen, which, is not eradicated followingacute infection, but remains latent in the host. Maintenance of equilibrium between the virus andthe immune mechanisms of the host, mainly CD4+ and CD8+ cellular immune responses, isessential. In case of disruption of this equilibrium, as in the Haematopoietic Stem CellTransplantation (HSCT) setting, there is a substantial risk of development of potentially lethalCMV disease, which is still of great concern, despite the preemptive administration of antiviralagents. Drug toxicity, disruption of reconstitution of CMV specific T-cell responses by antiviralagents and emergence of resistant CMV strains, are to be accounted for this. Optimization ofantiviral treatment protocols requires additional laboratory indices for (1) disease progressionand treatment success and (2) identification of patients at risk of end-organ CMV disease.Immune reconstitution of CMV specific immune responses post HSCT has been widelystudied, especially after the invention of MHC tetramers, which have provided a fast method forthe quantification of antigen specific CD8+ cells and enabled the simultaneous study ofadditional indices. Even though prompt immune reconstitution of CMV specific CD4+ andCD8+ T cells has been shown to protect from CMV reactivations and end organ disease, there isstill no consensus as to the role of the immune reconstitution studies in shaping antiviraltreatment. Main points of disagreement concern the significance of functional methods (mainlyfor cytokine production) and the identification of immunodominant peptides.The present study aimed to investigate the value of the assessment of CMV specificimmune reconstitution in the paediatric HSCT setting, using pp65 NLVPLMATV loaded MHCA*0201 tetramers, in conjunction with the simultaneous study of CD45RA and CD62Lexpression, which has been correlated with cell function. CD28 expression was additionallystudied on total CD8+ cells.We studied 11 consecutive MHC A*0201+ children submitted to allogeneic HSCT in“Aghia Sophia” Children’s Hospital, the main additional selection criterion being CMVseropositivity of either the donor or recipient. CMV pp65 specific CD8+ cells were studiedbefore and 5, 7, 9, 11 and 15 weeks post HSCT. Donor or graft specimens were also studied. Theaforementioned laboratory indices were correlated with occurrence of CMV infection (asassessed by pp65 antigenaemia or DNAaemia) and with clinical course. CMV reactivation wasdiagnosed in 5 patients, in 3 of whom the infection was recurrent/persistent. No case with CMVdisease was recorded.The main findings were as follows:(1) pp65 specific CD8+ cell reconstitution, as well as CD45RA and CD62L expressionpatterns, were greatly influenced by the occurrence of CMV reactivation. Accordingly, 4different patterns of CMV specific reconstitution are proposed. (2) Based on the aforementioned observation, samples were separated into two groups,according to prior occurrence of CMV reactivation, which is proposed as an essential criterionfor the interpretation of the immune reconstitution results.(3) In case of no prior reactivation, rapid reconstitution of pp65 specific CD8+ cells wassignificantly correlated with protection against persistent/recurrent CMV infection. However,failure to detect pp65 specific CD8+ cells, prior to reactivation, could not identify patients atrisk, a finding that could be attributed to the possibility of an alternative immunodominantepitope specificity in many patients.(4) Elevation of CD45RA expression rate on CMV specific CD8+ cells, when comparedto CD45RA expression on total CD8+, was observed in samples preceding a CMV reactivation.(5) In case of prior occurrence of CMV reactivation, enumeration of pp65 specificCD8+ cells did not seem to predict recurrent/persistent CMV infection. However, it is postulatedthat their numerical elevation, following a reactivation episode, may denote an underlying abilityto mount an antigen specific immune response and, thus, protection against end-organ CMVdisease.(6) Following an episode of CMV reactivation, the risk of future additional episodeswas related to (a) low CD3 count, (b) a shift towards central memory and effector CD8+ cells,with low percentage of naïve CD8+ cells, (c) elevation of CD8dim cell proportion to CD8++cells. Further studies are needed to test if the above could constitute risk factors for futurereactivations.The above results are summarized in a proposed algorithm for the assessment ofimmune reconstitution studies. Further HSCT cases are being assessed to evaluate theaforementioned results and to identify additional risk factors.

Ο Κυτταρομεγαλοϊός (CMV) είναι ένας ιδιαίτερα διαδεδομένος β-ερπητοϊός, ο οποίος μετά την πρωτολοίμωξη παραμένει σε λανθάνουσα κατάσταση στον ξενιστή. Η διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ του ιού και ανοσοποιητικού συστήματος έχει ως αποτέλεσμα την απουσία κλινικής συμπτωματολογίας. Σημαντικό ρόλο σε αυτή την ισορροπία έχει δειχθεί ότι διαδραματίζει ή ειδική CD4+ και CD8+ κυτταρική ανοσοαπάντηση. Για το λόγο αυτό, σε περιπτώσεις διαταραχής της Τ-κυτταρικής ανοσοαπάντησης, όπως κατά την Μεταμόσχευση Αιμοποιητικών Κυττάρων (ΜΑΚ), ο κίνδυνος εμφάνισης δυνητικά θανατηφόρας CMV νόσου,είναι σημαντικός, ακόμη και με την εφαρμογή πρωτοκόλλων προληπτικής (preemptive)χορήγησης αντιιικής αγωγής, τα οποία τον έχουν μειώσει, αλλά όχι μηδενίσει. Σε αυτό συμβάλλουν (1) η άμεση τοξικότητα των ίδιων των αντιικών φαρμάκων, (2) το γεγονός ότι η χορήγησή τους μειώνει την ικανότητα ανάπτυξης επαρκούς ειδικής έναντι του CMV κυτταρικής ανοσοαπάντησης και (3) η εμφάνιση αντοχής στα χρησιμοποιούμενα φάρμακα. Για τη βελτιστοποίηση της αντιμετώπισης της χορηγούμενης αγωγής, είναι επιθυμητή η εύρεση κατάλληλων εργαστηριακών δεικτών ανίχνευσης των ατόμων με αυξημένη πιθανότητα εμφάνισης CMV νόσου, με προσβολή των οργάνων στόχων.Η αξία της παρακολούθησης της ειδικής για τον CMV ανοσιακής αποκατάστασης μετά τη ΜΑΚ προς αυτή την κατεύθυνση, έχει αποτελέσει αντικείμενο εκτεταμένης μελέτης,ιδιαίτερα μετά την εισαγωγή της μεθόδου των MHC τετραμερών, η οποία επιτρέπει την ταχεία ποσοτική και περαιτέρω ανοσοφαινοτυπική μελέτη των αντιγονοειδικών Τ-λεμφοκυττάρων.Παρόλο που από καιρό έχει δειχθεί ότι η ταχεία αποκατάσταση των CD8+ και των CD4+ειδικών Τ-λεμφοκυττάρων συσχετίζεται με μειωμένη νοσηρότητα και θνησιμότητα από τονCMV, δεν έχει ακόμη επιτευχθεί συμφωνία, ως προς τη συμβολή της μελέτης τους στην τροποποίηση της αντιιικής αγωγής, το οποίο είναι ένα βασικό ζητούμενο. Οι βασικότερες διαφορές αφορούν στο ρόλο της μετρούμενης μέσω της παραγωγής κυτταροκινών λειτουργικότητας των αντιγονοειδικών Τ-λεμφοκυττάρων και στην ταυτοποίηση των καταλληλότερων προς μελέτη ανοσοεπικρατούντων πεπτιδίων του ιού.Στην παρούσα μελέτη, επιχειρήθηκε η διερεύνηση της αξίας της μελέτης αποκατάστασης των ειδικών για το πεπτίδιο NLVPLMATV της φωσφοπρωτεΐνης pp65 του CMV, CD8+λεμφοκυττάρων, μετά τη ΜΑΚ. Έγινε χρήση συνδυασμού MHC I τετραμερών και των ανοσοφαινοτυπικών δεικτών CD45RA και CD62L, η έκφραση των οποίων έχει συσχετιστεί με τη λειτουργικότητα των CD8+ λεμφοκυττάρων, ενώ έγινε, επιπλέον των παραπάνω, μελέτη που δείκτη CD28 επί του συνόλου των CD8+ λεμφοκυττάρων.Μελετήθηκαν 11 MHC A*0201+ ασθενείς που υποβλήθηκαν σε ΜΑΚ στο Γ.Ν.Π. «Η Αγία Σοφία» και ήταν CMV οροθετικοί, είτε εκείνοι είτε οι δότες των μοσχευμάτων. Επίσης,μελετήθηκε και ένας MHC A*0201+ CMV οροαρνητικός ασθενής με οροαρνητικό δότη. Ο έλεγχος έγινε στους δότες ή στα μοσχεύματα , άπαξ, και στους λήπτες προ της ΜΑΚ και 3, 5, 9,11 και 15 εβδομάδες μετά τη ΜΑΚ. Τα εργαστηριακά ευρήματα συσχετίστηκαν με την εμφάνιση CMV λοίμωξης (με βάση κυρίως την ανίχνευση pp65 αντιγοναιμίας ή DNAαιμίας)και την κλινική πορεία των ασθενών.Τα βασικότερα συμπεράσματα ήταν ότι: (1) Η αποκατάσταση των ειδικών για την pp65CD8+ λεμφοκυττάρων και τα πρότυπα έκφρασης των μελετώμενων δεικτών επηρεάζονταν σημαντικά από την εμφάνιση ή όχι αναζωπύρωσης του ιού. Προτείνονται 4 διακριτά πρότυπα αποκατάστασης. (2) Λόγω της παραπάνω παρατήρησης, θεωρήθηκε σημαντικός ο διαχωρισμός των δειγμάτων με βάση την ύπαρξη ή όχι προηγηθείσας αναζωπύρωσης του CMV, η οποία προτείνεται σαφώς ως βασικό κριτήριο για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων μελέτης της ανοσιακής αποκατάστασης μετά τη ΜΑΚ. 3) Σε περίπτωση που δεν είχε προηγηθεί αναζωπύρωση, η ταχεία αποκατάσταση των ειδικών για την pp65 CD8+ λεμφοκυττάρων,συσχετιζόταν σημαντικά με μειωμένο κίνδυνο μελλοντικής εμφάνισης επιμένουσας/υποτροπιάζουσας CMV λοίμωξης. Αντίθετα, η αδυναμία ανίχνευσης των εν λόγω αντιγονοειδικών κυττάρων, δεν αποτελούσε ασφαλές κριτήριο αυξημένου κινδύνου, πιθανόν λόγω του ενδεχομένου ανοσιακής απάντησης έναντι διαφορετικών ανοσοεπικρατούντων πεπτιδίων σε ορισμένους από τους ασθενείς. (4) Αύξηση του ποσοστού έκφρασης του μορίουCD45RA επί των αντιγονοειδικών CD8+ λεμφοκυττάρων, σε σύγκριση με την αντίστοιχη επίτ ου συνόλου των CD8+ κυττάρων, παρατηρήθηκε σε δείγματα που προηγούνταν άμεσα της εμφάνισης αναζωπυρώσεων. (5) Σε περίπτωση προηγηθείσας αναζωπύρωσης του CMV, η μελέτη των ειδικών για την pp65 CD8+ λεμφοκυττάρων δεν φάνηκε να έχει αξία για την πρόγνωση της υποτροπιάζουσας/επιμένουσας CMV λοίμωξης. Πιθανολογείται, όμως, ότι η αύξηση του αριθμού τους αποτελούσε ένδειξη ικανότητας ανάπτυξης ειδικής ανοσιακής απάντησης και, συνεπώς, μειωμένου κινδύνου ανάπτυξης θανατηφόρου νόσου από τον ιό. (6)Μετά την εμφάνιση αναζωπύρωσης του ιού, παράγοντες, όπως (α) ο μειωμένος συνολικός αριθμός των Τ-λεμφοκυττάρων, (β) η σημαντική επικράτηση των κεντρικών μνημονικών και των ανοσοδραστικών CD8+ λεμφοκυττάρων έναντι των αντίστοιχων παρθένων και (γ) ηα ύξηση της αναλογίας των CD8dim λεμφοκυττάρων επί του συνόλου των CD8+, μπόρεσαν να συσχετιστούν με την πιθανότητα επόμενης αναζωπύρωσης και προτείνονται ως παράμετροι των οποίων η περαιτέρω μελέτη θα μπορούσε να αναδείξει προγνωστικούς δείκτες ανταπόκρισης στη θεραπεία.Τα παραπάνω αποτελέσματα συνοψίζονται σε έναν προτεινόμενο αλγόριθμο αξιολόγησης των αποτελεσμάτων της μελέτης της ανοσιακής απάντησης μετά τη ΜΑΚ, ο οποίος βασίζεται στο κριτήριο της προηγηθείσας αναζωπύρωσης και του οποίου η αξία μελετάται με τον έλεγχο επιπλέον δειγμάτων.