Διερεύνηση του ρόλου της συνδεδεμένης με τις λιποπρωτεΐνες φωσφολίπασης A2 (Lp - PLA2) στην πρόσληψη της οξειδωμένης LDL από τα μακροφάγα

Abstract

Recognition and uptake of oxidized LDL (oxLDL) by scavenger receptors ofmacrophages and foam cell formation are mediated by the oxidatively modifiedapolipoprotein B (ApoB) and the lipid moiety of oxLDL. Lipid moiety exhibits a dual roleconcerning recognition of oxLDL by scavenger receptors. Lipid oxidation products have theability to bind to ApoB causing derivatization of lysine residues which results in increasedrecognition of ApoB molecule by scavenger receptors and furthermore oxidized lipidsindependently of their association with ApoB can serve as strong ligands for scavengerreceptors. A great amount of oxidized phosphatidylcholine (oxPC) of oxLDL is hydrolyzedat the sn-2 position by lipoprotein associated phospholipase A2 (Lp-PLA2) tolysophosphatidylcholine and small products of hydrolysis. This study examined theinvolvement of Lp-PLA2 in the binding and the uptake of oxLDL by macrophages. For thispurpose, LDL with intact Lp-PLA2 activity [LDL(+)] and LDL with inhibited Lp-PLA2activity [LDL(-)] were used. Inhibition of Lp-PLA2 activity was achieved by incubation ofLDL with 1 mM pefabloc prior to oxidation.It is known that during the LDL oxidation the Lp-PLA2 activity progressively decreases.Consistent with the previous findings, in our experiments, during LDL oxidation with 5μMCuSO4, the remaining Lp-PLA2 activity after 6 h was approximately 40–50%, and after 24 honly 10–15% of the initial activity was preserved. The extent of the hydrolysis of oxPC andthe lipid peroxidation were estimated by determination of the lysoPC/PC molar ratio andlevels of MDA respectively. LysoPC/PC molar ratio was ~ 0,05 at native LDL and ~ 0,24and ~ 0,36 after 6 h or 24 h oxidation, respectively. MDA levels expressed as nmoles /mgprotein of LDL were ~ 1,8 at native LDL and ~ 33,5 and ~ 44,2 after 6 h or 24 h oxidation,respectively. These two time intervals were used, and LDL was oxidized for 6 h (moderatelyoxidized LDL, MoxLDL) or 24 h (heavily oxidized LDL, HoxLDL) to assess the possibledifference between a shorter oxidation with the major percentage of Lp-PLA2 activitypresent and a longer oxidation during which Lp-PLA2 activity was significantly attenuated. Binding and uptake of MoxLDL and HoxLDL prepared from LDL(+) or LDL(-) andlabelled with FITC were assessed by incubation with mouse peritoneal macrophages at 40Cor 370C respectively. The binding and the uptake of MoxLDL(-) were increased by about30% compared with those of MoxLDL(+), and HoxLDL(-) binding and uptake wereincreased by about 20% compared with those of HoxLDL(+). Incubation with pefabloc at theend of the oxidation did not alter the binding or the uptake of MoxLDL or HoxLDL oxidizedin the presence of Lp-PLA2 activity, indicating no direct effect of pefabloc on oxLDLbinding and uptake other than the inhibition of Lp-PLA2 activity.Provided that macrophage receptors recognize both the protein and the lipid moieties ofoxLDL, our next goal was to distinguish which of the two moieties is responsible for theincreased binding and uptake of oxLDL(-). The implication of ApoB was examined byassessing the binding and the uptake of ApoB-liposome conjugates containing ApoB isolatedfrom oxLDL. ApoB from oxLDL was incorporated into ApoB-liposome conjugatesconsisting of dipalmitoyl- phoshatidylcholine (DPPC), cholesterol and ApoB in theproportion 10:5:2 (weight ratio). The ApoB-liposome conjugates were prepared by adetergent solubilization and removal method using as detergent octyl glycoside (OG), as ithas been shown that treatment of ApoB with OG does not affect the binding of ApoB fromoxLDL to macrophage receptors. To examine if the ApoB was conjugated to the liposomes,ApoB-liposome conjugates were labelled with [14C]1,2-dipalmitoyl-phosphatidylcholine([14C]DPPC) and these [14C]DPPC-ApoB liposome conjugates were subjected toultracentrifugation at a density of 1,14 g/mL. The recovery of both the protein and the[14C]DPPC radioactivity at the upper layer were greater than 95%. The use of ApoBliposomeconjugates containing ApoB from oxLDL resulted in binding and uptake whichwere by far greater compared with the corresponding values obtained by unconjugatedliposomes which were negligible. The binding and the uptake of [14C]ApoB-liposomeconjugates containing ApoB from oxLDL was inhibited in a concentration-dependentmanner by oxLDL, while native LDL had only minor inhibitory effect. These results suggestthat the incorporated into proteoliposomes ApoB preserves its ability to bind to macrophagereceptors. The inhibition of Lp-PLA2 activity had no effect on the uptake of [14C]ApoBliposomesconjugates prepared with ApoB isolated from MoxLDL(-), MoxLDL(+),HoxLDL(-), and HoxLDL(+). The binding and the uptake of [14C]ApoB-liposomeconjugates containing ApoB from MoxLDL or HoxLDL was unaffected by treatment withpefabloc at the end of oxidation. This finding was in agreement with the results mentioned above concerning the oxLDL binding and uptake, indicating once again no direct effect ofpefabloc on receptor binding.To examine the possibility that products of oxPC hydrolysis by Lp-PLA2 can bind onApoB, we used as a substrate 1-palmitoyl-2-[1- 14 C]arachidonoyl-phosphatidylcholine, [14C]PAPC which has been oxidized with incubation with 5μM CuSO4 for 24h. Ox[14C] PAPCwas treated with Lp-PLA2 partially purified from LDL, and the radioactive low molecularweight products of hydrolysis released by Lp-PLA2 from the sn-2 position were isolated.Incubation of these low molecular weight products of hydrolysis with LDL(+) or LDL(-)revealed their ability to bind to ApoB in a degree comparable to that observed afterincubation with ox[14C]PAPC. A plausible explanation of the similar uptake of ApoB fromoxLDL(+) or oxLDL(-) in our study could be that the low molecular weight products ofhydrolysis of oxPC, released by Lp-PLA2 from the sn-2 position, are also able to sufficientlyderivatize ApoB.The role of Lp-PLA2 in the binding and the uptake of oxLDL via the lipid moiety wasinvestigated using [14C]DPPC-labeled liposomes prepared from the lipid extract ofMoxLDL(-), MoxLDL(+), HoxLDL(-), and HoxLDL(+). The binding and the uptake ofthese liposomes exhibited a similar pattern to that of the corresponding FITC-labeledlipoproteins. Incubation with liposomes from MoxLDL(-) lipids resulted in greater bindingand uptake compared with those of liposomes from MoxLDL(+) lipids by ~ 40%. Similarly,the inhibition of Lp-PLA2 led to increased binding and uptake, though to a lesser extent, ofliposomes from HoxLDL(-) lipids compared with those of liposomes from HoxLDL(+)lipids by ~ 30%.To further investigate the increased binding and uptake of oxLDL via its lipid moietycaused by inhibition of Lp-PLA2, we examined the ability of oxidized 2-arachidonoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (oxPAPC), oxidized 2-linoneloyl-1-palmitoyl-snglycero-3-phosphocholine (oxPLPC) and their lyso derivative 1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine as well as the ability of oxidized 1,2-dioleoyl-sn glycero-3-phosphocholine(oxDOPC) and its lyso derivative 1-oleoyl-sn-glycero-phosphocholine to mediate bindingand uptake. Oxidation of phosholipids was carried out with incubation with 5μM CuSO4 for24h. PAPC, PLPC and DOPC were included in the study as they represent commonphosphatidylcholine molecules with polyunsaturated (PAPC, PLPC) or monounsaturated(DOPC) acyl chains at the sn-2 position. Moreover, several molecules derived fromoxidation of PAPC and PLPC have been shown to serve as ligands for scavenger receptorsand furthermore are potentially susceptible to LpPLA2 hydrolysis as this has been demonstrated in the case of molecules derived from oxidation of PAPC such as 1-palmitoyl-2-(5-oxovaleroyl)-sn-glycero-3-phosphocholine (POVPC). Liposomes containingcholesterol, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) as saturatedphosphatidylcholine component and the phosphatidylcholine molecule of interest, in amolecular ratio 2:1 between total phospholipids and cholesterol, were prepared. Liposomeslabelled with [14C]DPPC were used in direct binding and uptake studies, while unlabelledpreparations were used for inhibition studies. The oxPAPC liposomes exhibited significantbinding and uptake, reaching approximately 60-70% of the binding and the uptake ofliposomes from HoxLDL(-) lipids. Incubation with oxPLPC liposomes or lysoPC liposomesresulted in approximately 30% of the binding and the uptake of oxPAPC liposomes. TheoxDOPC liposomes revealed even less binding and uptake. The binding and the uptake ofliposomes containing unoxidized PAPC or unoxidized PLPC were much lesser than thosecontaining the corresponding oxidized phospholipids while binding and uptake of liposomescontaining exclusively DPPC as phospholipid component, were negligible. The oxPAPCliposomes as well the oxPLPC liposomes but also the lysoPC liposomes exhibited a receptormediated pattern of binding and uptake as a dose-dependent inhibition of the binding and theuptake of labelled preparations by unlabelled preparations of the same lipososomes as wellby MoxLDL(+) and HoxLDL(+) or MoxLDL(+) lipids liposomes and HoxLDL(+)lipidsliposomes but not by LDL(+) or LDL(+) lipids liposomes, was observed. The pattern of theresults of studies assessing the ability of unlabelled liposomes to compete labelled oxLDLand oxLDL-lipids liposomes for binding or uptake was corresponding to that of the directstudies of binding and uptake, with liposomes containing oxPAPC revealing strong capacityto inhibit binding and the uptake of MoxLDL(+) or MoxLDL(+)-lipids liposomes orMoxLDL(-)-lipids liposomes by approximately 70-80%. In the present study, it was shown that inhibition of Lp-PLA2 activity prior to oxidationof LDL, results in increased recognition of lipid moiety by macrophage receptors andsubsequent increased uptake of oxLDL. This effect is more pronounced in moderateoxidation (6h) rather than heavy oxidation (24h), probably due to gradual inactivation of Lp-PLA2 during oxidation. Besides the progressive loss of Lp-PLA2 activity during oxidation,the preserved recognition via ApoB and probably the production of oxidized phospholipidswith long chains at the sn-2 position which act as ligands for scavenger receptors but are notsensitive to hydrolysis by Lp-PLA2, represent possible factors that tend to attenuate thedifference in the binding and the uptake between oxLDL(+) and oxLDL(-). Regarding thedecreased recognition of oxLDL lipid moiety by macrophage receptors caused by the Lp PLA2 activity, this is probably mainly due to reduction of oxPAPC molecules which serve asstrong ligands for these receptors.The results of this study support the conclusion that the progressive inactivation of Lp-PLA2 during LDL oxidation leads to an increased recognition of oxLDL by macrophagereceptors which could be primarily attributed to the increased recognition of the oxidizedphospholipids enriched lipid moiety of oxLDL.

Η αναγνώριση και η πρόσληψη της οξειδωμένης LDL (oxidized LDL, oxLDL) από τους εκκαθαριστές υποδοχείς των μακροφάγων και ο σχηματισμός των αφρωδών κυττάρων μεσολαβούνται από την οξειδωτικά τροποποιημένη απολιποπρωτεΐνη Β100 (apolipoproteinB100, ApoB100) και την λιπιδική ομάδα της oxLDL. Η λιπιδική ομάδα επιδεικνύει ένα διπλό ρόλο όσον αφορά στην αναγνώριση της oxLDL από τους εκκαθαριστές υποδοχείς.Προϊόντα οξείδωσης λιπιδίων έχουν την ικανότητα να συνδέονται στην ApoB με το σχηματισμό ενώσεων με κατάλοιπα λυσίνης, με αποτέλεσμα την αυξημένη αναγνώριση του μακρομορίου της ApoB από τους εκκαθαριστές υποδοχείς και επιπλέον οξειδωμένα λιπίδια λειτουργούν σαν ισχυροί συνδέτες των εκκαθαριστών υποδοχέων, ανεξάρτητα από τη σύνδεση τους με την ApoB. Μία σημαντική ποσότητα οξειδωμένης φωσφατιδυλοχολίνης (oxidized phosphatidylcholine, oxPC) της oxLDL υδρολύεται στην sn-2 θέση από τη συνδεδεμένη με τις λιποπρωτεΐνες φωσφολιπάση Α2 (lipoprotein associated phospholipaseA2, Lp-PLA2) σε λυσοφωφατιδυλοχολίνη (lysophosphatidylcholine, lysoPC) και μικρά προϊόντα υδρόλυσης. Η εργασία αυτή εξέτασε τη συμμετοχή της Lp-PLA2 στη σύνδεση καιστην πρόσληψη της oxLDL από μακροφάγα. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν LDL με ακέραιη τη δραστικότητα της Lp-PLA2 [LDL(+)] και LDL με ανεσταλμένη τη δραστικότητα της Lp-PLA2 [LDL(-)]. Αναστολή της δραστικότητας της Lp-PLA2 επιτεύχθηκε με επώασηLDL με 1 mM pefabloc πριν την οξείδωση.Είναι γνωστό πως κατά τη διάρκεια της οξείδωσης της LDL η δραστικότητα της Lp-PLA2 προοδευτικά μειώνεται. Σε συμφωνία με τα προηγούμενα ευρήματα, στα πειράματά μας κατά τη διάρκεια οξείδωσης LDL με 5μM CuSO4, η εναπομείνουσα δραστικότητα τηςLp-PLA2 μετά από 6 h ήταν περίπου 40–50%, και μετά από 24 h μόνο 10–15% της αρχικής δραστικότητας είχε διατηρηθεί. Η έκταση της υδρόλυσης της oxPC και της λιπιδικής υπεροξείδωσης εκτιμήθηκαν με προσδιορισμό αντίστοιχα της μοριακής αναλογίαςlysoPC/PC και των επιπέδων MDA. Η μοριακή αναλογία lysoPC/PC ήταν ~ 0,05 στη φυσική LDL και ~ 0,24 και ~ 0,36 μετά από 6 h ή 24 h οξείδωσης, αντίστοιχα. Τα επίπεδα MDA, εκφραζόμενα σε nmoles/mg πρωτεΐνης LDL, ήταν ~ 1,8 στη φυσική LDL και ~ 33,5 και ~ 44,2 μετά από 6 h ή 24 h οξείδωσης, αντίστοιχα. Χρησιμοποιήθηκαν τα δύο αυτά χρονικά διαστήματα, και η LDL οξειδώθηκε για 6 h (μέτρια οξειδωμένη LDL, moderatelyoxidized LDL, MoxLDL) ή 24 h (ισχυρά οξειδωμένη LDL, heavily oxidized LDL,HoxLDL) για να ελεγχθεί η πιθανή διαφορά μεταξύ ενός βραχύτερου διαστήματος οξείδωσης με παρόν το μεγαλύτερο μέρος της δραστικότητας της Lp-PLA2 και ενός μεγαλύτερου διαστήματος κατά τη διάρκεια του οποίου σημαντικό μέρος της δραστικότηταςτης Lp-PLA2 έχει απωλεστεί. Η σύνδεση και η πρόσληψη MoxLDL και HoxLDL, παρασκευασμένων από LDL(+) ήLDL(-) και σημασμένες με FITC, εξετάστηκαν με επώαση με περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού στους 40C ή 370C αντίστοιχα. Η σύνδεση και η πρόσληψη της MoxLDL(-) ήταν περίπου κατά 30% αυξημένες σε σύγκριση με εκείνες της MoxLDL(+), και η σύνδεση και η πρόσληψη της HoxLDL(-) ήταν περίπου κατά 20% αυξημένες σε σύγκριση με εκείνες τηςHoxLDL(+). Επώαση με pefabloc στο τέλος της οξείδωσης δεν μετέβαλε τη σύνδεση και τη πρόσληψη της MoxLDL ή της HoxLDL που οξειδώθηκαν παρουσία της δραστικότητας τηςLp-PLA2, δεικνύοντας ότι δεν υπάρχει άλλη άμεση επίδραση του pefabloc στη σύνδεση και στην πρόσληψη της oxLDL εκτός από την αναστολή της δραστικότητας της Lp-PLA2.Με δεδομένο ότι οι υποδοχείς των μακροφάγων αναγνωρίζουν και την πρωτεϊνική και τη λιπιδική ομάδα της oxLDL, ο επόμενος στόχος μας ήταν να διακρίνουμε για πρώτη φορά ποιά από τις δύο ομάδες ήταν υπεύθυνη για την αυξημένη σύνδεση και πρόσληψη τηςoxLDL(-). Η εμπλοκή της ApoB εξετάστηκε αξιολογώντας τη σύνδεση και την πρόσληψηApoB-πρωτεϊνολιποσωμάτων που περιείχαν ApoB απομονωμένη από oxLDL. Για το σκοπό αυτό, ApoB από oxLDL ενσωματώθηκε σε ApoB-πρωτεϊνολιποσώματα αποτελούμενα από 1,2-διπαλμυτόϋλο-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνη (dipalmitoyl-phoshatidylcholine, DPPC),χοληστερόλη και ApoB στην αναλογία 10:5:2 (αναλογία βάρους). Τα ApoB-πρωτεϊνολιποσώματα παρασκευάστηκαν με μέθοδο διαλυτοποίησης με χρήση απορρυπαντικού και με ακόλουθη απομάκρυνσή του, χρησιμοποιώντας σαν απορρυπαντικό το octyl glycoside (OG), καθώς έχει δειχθεί οτι επώαση της ApoB με OG δεν επηρεάζει τη σύνδεση της ApoB από oxLDL στους υποδοχείς των μακροφάγων. Για να εξετάσουμε εάν ηApoB είναι συζευγμένη στα λιποσώματα, ApoB-πρωτεϊνολιποσώματα σημάνθηκαν με[14C]DPPC και αυτά τα [14C]DPPC-ApoB-πρωτεϊνολιποσώματα υποβλήθηκαν σε υπερφυγοκέντρηση σε πυκνότητα 1,14 g/mL. Η ανάκτηση και της πρωτεΐνης και της[14C]DPPC ραδιενέργειας στην ανώτερη στοιβάδα ήταν μεγαλύτερες από 95%. Οι τιμές σύνδεσης και πρόσληψης των πρωτεϊνολιποσωμάτων που περιείχαν ApoB από oxLDL ήταν κατά πολύ μεγαλύτερες των αντίστοιχων τιμών των μη συνδεδεμένων με πρωτεΐνηλιποσωμάτων μαρτύρων. Η σύνδεση και η πρόσληψη των [14C]-ApoB-πρωτεϊνολιποσωμάτων που περιείχαν ApoB από oxLDL αναστελλόταν με εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο από την oxLDL, ενώ η φυσική LDL είχε μόνο μικρή ανασταλτική επίδραση. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν διατήρηση της ικανότητας σύνδεσης της ενσωματωμένης στα πρωτεϊνολιποσώματα ApoB με τους υποδοχείς των μακροφάγων. Η αναστολή της δραστικότητας της Lp-PLA2 δεν είχε επίδραση στη σύνδεση ή στην πρόσληψη των [14C]-ApoB-πρωτεϊνολιποσωμάτων που παρασκευάστηκαν από ApoB απομονωμένη από MoxLDL(-), MoxLDL(+), HoxLDL(-), και HoxLDL(+). Η σύνδεση και η πρόσληψη των[14C]-ApoB-πρωτεϊνολιποσωμάτων που περιείχαν ApoB από MoxLDL ή HoxLDLέμεινε ανεπηρέαστη από την επώαση με pefabloc στο τέλος της οξείδωσης. Το εύρημα αυτό ήταν σύμφωνο με τα αποτελέσματα που αναφέρθηκαν ανωτέρω όσον αφορά στη σύνδεση και στην πρόσληψη της ακέραιης oxLDL, υποδεικνύοντας ξανά τη μή ύπαρξη άμεσης επίδρασης του pefabloc στη σύνδεση στους υποδοχείς.Για να εξετάσουμε την πιθανότητα προϊόντα υδρόλυσης της oxPC από την Lp-PLA2 να μπορούν να συνδέονται στην ApoB, χρησιμοποιήσαμε σαν υπόστρωμα 1-παλμιτόϋλο-2-[1-14C]αραχιδονόϋλο-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνη (1- palmitoyl – 2 - [1-14C]arachidonoyl –phosphatidylcholine, [14C]PAPC) η οποία είχε οξειδωθεί με επώαση με 5μM CuSO4 για 24h. Ox[14C]PAPC επωάστηκε με Lp-PLA2 μερικώς καθαρισμένη από LDL, και τα ραδιενεργά χαμηλού μοριακού βάρους προϊόντα της υδρόλυσης που απελευθερώθηκαν από την Lp-PLA2 από την sn-2 θέση απομονώθηκαν. Επώαση αυτών των χαμηλού μοριακού βάρους προϊόντων της υδρόλυσης με LDL(+) ή LDL(-) ανέδειξε για πρώτη φορά την ικανότητά τους να συνδέονται με την ApoB σε βαθμό παραπλήσιο αυτού που παρατηρήθηκε μετά από επώαση με ox[14C]PAPC. Μία εύλογη εξήγηση της παρόμοιας πρόσληψης τηςApoB από oxLDL(+) ή oxLDL(-) στην εργασία μας, θα μπορούσε να είναι το ότι χαμηλού μοριακού βάρους προϊόντα της υδρόλυσης της oxPC, που απελευθερώνονται από την Lp-PLA2 από την sn-2 θέση, είναι επίσης ικανά να τροποποιούν επαρκώς την ApoB.Ο ρόλος της Lp-PLA2 στη σύνδεση και στην πρόσληψη της oxLDL μέσω της λιπιδικής ομάδας εξετάστηκε χρησιμοποιώντας σημασμένα με [14C]DPPC λιποσώματα παρασκευασμένα από τα λιπίδια που εκχυλίστηκαν από MoxLDL(-), MoxLDL(+),HoxLDL(-), και HoxLDL(+). Η σύνδεση και η πρόσληψη αυτών των λιποσωμάτωνεπέδειξαν όμοιο πρότυπο με αυτό των αντίστοιχων σημασμένων με FITC λιποπρωτεϊνών. Επώαση με λιποσώματα από MoxLDL(-) λιπίδια οδήγησε σε μεγαλύτερη κατά ~ 40%σύνδεση και πρόσληψη σε σύγκριση με αυτές των λιποσωμάτων από MoxLDL(+) λιπίδια.Παρομοίως, η αναστολή της Lp-PLA2 οδήγησε σε αυξημένη σύνδεση και πρόσληψη, αν και σε μικρότερο βαθμό, των λιποσωμάτων από HoxLDL(-) λιπίδια κατά ~ 30% σε σύγκριση με αυτές των λιποσωμάτων από HoxLDL(+) λιπίδια.Για να διερευνήσουμε περαιτέρω την αυξημένη σύνδεση και πρόσληψη της oxLDLμέσω της λιπιδικής ομάδας που προκαλείται από την αναστολή της Lp-PLA2, εξετάσαμε την ικανότητα της οξειδωμένης 1-παλμιτόϋλο-2-αραχιδονόϋλο-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνης(oxidized 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, oxPAPC), τηςοξειδωμένης 1-παλμιτόϋλο-2-λινελαϊκόϋλο-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνης (oxidized 1-palmitoyl-2-linoneloyl- sn-glycero-3-phosphocholine, oxPLPC) και του λυσο-παραγώγουτους, της 1 – παλμιτόϋλο – sn – γλυκερο – 3 - φωσφοχολίνης (1 – palmitoyl – sn – glycerol– 3 -phosphocholine), όπως επίσης και την ικανότητα της οξειδωμένης 1,2-ελαϊκόϋλο-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνη (oxidized 1,2-dioleoyl-sn glycero-3-phosphocholine, oxDOPC) και του λυσο-παραγώγου της, της 1-ελαϊκόϋλο-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνη (1 – oleoyl – sn –glycerol - phosphocholine), να μεσολαβούν στη σύνδεση και στην πρόσληψη. Η οξείδωση των φωσφολιπιδίων διενεργήθηκε με επώαση με 5μM CuSO4 για 24h. PAPC, PLPC καιDOPC συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη καθώς παριστούν κοινά μόρια φωσφατιδυλοχολίνης με πολυακόρεστες (PAPC, PLPC) ή μονοακόρεστες (DOPC) ακυλ- αλυσίδες στην sn-2 θέση.Επιπλέον, διάφορα μόρια προερχόμενα από την οξείδωση των PAPC και PLPC έχουν δειχθεί να λειτουργούν σαν συνδέτες για εκκαθαριστές υποδοχείς και περαιτέρω είναι δυνητικά ευάλωτα σε υδρόλυση από την LpPLA2, όπως έχει αποδειχτεί στην περίπτωση μορίων προερχόμενων από την οξείδωση PAPC, όπως η 1-παλμιτόϋλο-2-(5-κετοβαλερόϋλο)-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνη (1-palmitoyl-2-(5-oxovaleroyl)-sn-glycero-3-phosphocholine, POVPC). Παρασκευάστηκαν λιποσώματα που περιείχαν χοληστερόλη,DPPC σαν συστατικό κορεσμένης φωσφατιδυλοχολίνης, και το υπό εξέταση μόριοφωσφατιδυλοχολίνης, σε μοριακή αναλογία 2:1 μεταξύ ολικών φωσφολιπιδίων και χοληστερόλης. Λιποσώματα σημασμένα με [14C]DPPC χρησιμοποιήθηκαν σε άμεσες μελέτες σύνδεσης και πρόσληψης, ενώ μη σημασμένες παρασκευές χρησιμοποιήθηκαν σε μελέτες αναστολής. Tα oxPAPC λιποσώματα επέδειξαν σημαντική σύνδεση και πρόσληψη,φθάνοντας περίπου στο 60-70% της σύνδεσης και πρόσληψης των λιποσωμάτων απόHoxLDL(-) λιπίδια. Η επώαση με oxPLPC λιποσώματα ή lysoPC λιποσώματα είχε σαν αποτέλεσμα περίπου το 30% της σύνδεσης και της πρόσληψης που παρατηρήθηκε με τη χρησιμοποίηση oxPAPC λιποσωμάτων. Τα oxDOPC λιποσώματα έδειξαν ακόμη λιγότερη σύνδεση και πρόσληψη. Η σύνδεση και η πρόσληψη των λιποσωμάτων που περιείχαν μη οξειδωμένη PAPC ή μη οξειδωμένη PLPC ήταν πολύ μικρότερες αυτών που περιείχαν τα αντίστοιχα οξειδωμένα φωσφολιπίδια, ενώ η σύνδεση και η πρόσληψη λιποσωμάτων που περιείχαν αποκλειστικά DPPC σαν φωσφολιπιδικό συστατικό, ήταν αμελητέες. Τα oxPAPC λιποσώματα, όπως επίσης και τα oxPLPC λιποσώματα, αλλά και τα lysoPC λιποσώματα επέδειξαν πρότυπο σύνδεσης και πρόσληψης μεσολαβούμενων από υποδοχέα, καθώς παρατηρήθηκε μία δοσοεξαρτώμενη αναστολή της σύνδεσης και της πρόσληψης σημασμένων παρασκευών από μη σημασμένες παρασκευές του ίδιου λιποσώματος όπως και από MoxLDL(+) και HoxLDL(+) ή από λιποσώματα από MoxLDL(+) λιπίδια και λιποσώματα από HoxLDL(+) λιπίδια, όχι όμως από LDL(+) ή λιποσώματα από LDL(+)λιπίδια. Το πρότυπο των αποτελεσμάτων των μελετών που εξέτασαν την ικανότητα μη σημασμένων λιποσωμάτων να ανταγωνιστούν στη σύνδεση και στην πρόσληψη σημασμένες oxLDL ή σημασμένα λιποσώματα από oxLDL λιπίδια, ήταν αντίστοιχο αυτού των άμεσων μελετών σύνδεσης και πρόσληψης, με τα oxPAPC λιποσώματα να αναδεικνύουν ισχυρή ικανότητα να αναστέλλουν τη σύνδεση και την πρόσληψη της ακέραιης MoxLDL(+) και των λιποσωμάτων από MoxLDL(+) λιπίδια ή MoxLDL(-) περίπου κατά 70-80%.Στην παρούσα μελέτη, δείχθηκε ότι αναστολή της δραστικότητας της Lp-PLA2 πριν από την οξείδωση της LDL, έχει σαν αποτέλεσμα την αυξημένη αναγνώριση της λιπιδικής ομάδας από τους υποδοχείς των μακροφάγων και την επακόλουθη αυξημένη πρόσληψη τηςoxLDL. Η επίδραση αυτή είναι περισσότερο έκδηλη στη μέτρια οξείδωση (6h) από ότι στην ισχυρή οξείδωση (24h), πιθανότατα λόγω της προοδευτικής απενεργοποίησης της Lp-PLA2 κατά τη διάρκεια της οξείδωσης. Εκτός από την προοδευτική απώλεια της δραστικότητας της Lp-PLA2 κατά τη διάρκεια της οξείδωσης, η διατήρηση της αναγνώρισης μέσω τηςApoB και πιθανώς η παραγωγή οξειδωμένων φωσφολιπιδίων με μακρές αλυσίδες στην sn-2θέση, τα οποία θα μπορούσαν να δράσουν σαν συνδέτες των εκκαθαριστών υποδοχέων αλλά δεν είναι ευαίσθητα στην υδρόλυση από την Lp-PLA2, παριστούν πιθανούς παράγοντες που τείνουν να εξασθενίσουν τη διαφορά στη σύνδεση και στην πρόσληψη μεταξύ τηςoxLDL(+) και της oxLDL(-). Όσον αφορά στη μειωμένη αναγνώριση της λιπιδικής ομάδας της oxLDL από τους υποδοχείς των μακροφάγων η οποία προκαλείται από τη δραστικότητατης Lp-PLA2, αυτή πιθανώς οφείλεται σε σημαντικό βαθμό στη μείωση των μορίων τηςoxPAPC τα οποία δρουν σαν ισχυροί συνδέτες για αυτούς τους υποδοχείς.Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι η προοδευτική αναστολή της δραστικότητας της Lp-PLA2 κατά τη διάρκεια της οξείδωσης οδηγεί σε αυξημένη αναγνώριση της oxLDL από τους υποδοχείς των μακροφάγων και αυτό κυρίως αποδίδεται στην αυξημένη αναγνώριση της εμπλουτισμένης σε οξειδωμένα φωσφολιπίδιαλιπιδικής ομάδας της oxLDL.