Μελέτη πολυμορφισμών γονιδίων αποτοξίνωσης σε ασθενείς με πολλαπλή σκλήρυνση

Abstract

Introduction: Multiple Sclerosis (MS) is a major, inflammatory anddemyelinating, chronic disorder of the Central Nervous System (CNS),affecting most commonly young adults. It is generally considered to be anautoimmune disease and is characterized by multifocal damage of the CNS. Itis characterized by a variety with regard to the age of onset, the neurologicalmanifestations, the evolution and the disability level. The cause of MS isunknown; however, it is thought to be interplay between genetic andenvironmental factors. According to recent surveys the role of oxidative stressin MS susceptibility seems to be dominant. During the inflammatory events ofthe disease, a variety of reactive oxygen species (ROS) are produced, whichare potentially toxic. When the cellular capacity to neutralize ROS fails,oxidative stress occurs with detrimental effects on lipid membranes, proteinsand astrocytes’ nucleotides. Exogenous and endogenous products ofoxidative stress are metabolized by antioxidant phase I and II enzymes.The most significant enzymes of phase II are those that belong to glutathione-S-transferase family (GSTs) and the NQO1 reductase. GSTP1 enzymeactivity strongly depends on a single nucleotide polymorphism (SNP) at theGSTP1 gene locus. This A→G substitution at nucleotide 313 (A313G), resultsin an isoleucine to valine substitution (Ile105Val), affecting substrate-specificcatalytic activity and thermal stability of the encoded protein. Thus, individualshomozygous for the variant G allele (G/G) have a lower conjugating activitythan individuals homozygous for the wild type A allele (A/A), whileheterozygotes (A/G) display intermediate activity.The other two genes of the glutathione-S-transferase family (GSTs) Τ1 andΜ1 exhibit an inherited homozygous deletion polymorphism (null genotype)resulting the total absence of enzymatic activity in humans. The NAD(P)Hquinine oxidoreductase (NQO1) catalytic enzyme activity also stronglydepends on a single nucleotide polymorphism (SNP) (C609T). This C→Tsubstitution at nucleotide 187 (C609T), results in a proline-to-serinesubstitution at amino acid 187 of the mature protein that destabilizes andinactivates the enzyme. Individuals homozygous for the mutant allele (T/T)completely lack NQO1 activity, whereas heterozygotes (C/T) presentdecreased enzyme activity. Objective: The aim of the present study was to investigate, for the first time inGreek patients with MS, the possible association of specific polymorphisms ofGSTP1, GSTM1, GSTT1 και NQO1 genes with both the susceptibility to andthe clinical characteristics of the disease.Materials and methods: Genotypes were determined from 254 Greekpatients (94 males and 160 females) with clinically definite MS (based on McDonald’s criteria) and 370 (188 males and 182 females) healthy controls. Themean age of the disease onset was 35 years (18-83 years), whereas themean age of the controls was 50 years (20-85 years). Informed consent hasbeen obtained from all patients and controls and study was approved by theScientific Committee of the National and Kapodistrian University of Athens,that is, responsible for ethics. The Disability was assessed using the KurtzkeExpanded Disability Status Scale (EDSS) and the patients were stratified tothose mild disability (EDSS:0-4), moderate (EDSS:4,5-5,5) and severe(EDSS:6-10). Clinical data were available for 240 out of 254 patients. Patientswere also categorized according to their clinical subtype; RRMS (RelapsingRemitting MS), RPMS (Relapsing Progressing MS), PPMS (PrimaryProgressive MS) και SPMS (Secondary Progressive MS).Polymerase chain reaction (PCR) techniques were used to determine theabove polymorphisms; restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)and real time PCR were used for GSTP1 A313G and NQO1 C609Tpolymorphisms. The multiplex PCR was used to identify The GSTT1 καιGSTM1 null polymorphisms.Pearson’s chi square test was used for the statistical analysis of the genotypecontribution and the rest of the variable parameters evaluation (statisticallysignificant at the 95% level, p=0,05).Results: The major finding of this study is the significantly higher frequency ofheterozygous (C/T) and homozygous (T/T) individuals for the NQO1polymorphism observed among MS patients compared to controls.Interestingly, there is 3.7- fold possibility for MS patients to be T/T comparedto the donors. Considering allele frequencies our analysis showed a 1.5-foldincreased risk for MS patients to be carriers of at least one variant T allele,compared to controls. Classification of MS patients according to clinicalsubtypes revealed a higher frequency of homozygous (T/T) and heterozygous (C/T) individuals among patients belonging to the PPMS (Primary ProgressiveMultiple Sclerosis) subgroup, compared to the other MS subtypes. This resultwas confirmed by the allele frequency distribution analysis, with a higher Tallele frequency among PPMS patients. According to gender, a significanthigher frequency of A allele contribution was observed among female controls(1.5-fold). Interpreting the results, there is the likelihood of a protective role ofvariant A allele to females. Regarding classification of patients in clinicalsubtypes, a higher frequency of heterozygous A/G ones was observed inRRMS (Relapsing Remitting Multiple Sclerosis), as compared to the controls.The results of the present work suggest a putative role for the GSTP1heterozygosity in the RRMS subtype, especially in those presenting EDSS ≤2after 10-15 years from the disease onset. In MS patients there is an increasedfrequency of combined GSTP1 heterozygosity and NQO1 heterozygosity orNQO1 homozygosity T/T compared to controls (P- value=0.035, x2=5.33,d.f.=1, OR=0.56, 95%CI=0.345-0.919).With regard to GSTΜ1 polymorphism there is 2-fold risk and 1,8-fold risk forfemale patients to be GSTΜ1 null compared to the male patients and thefemale controls respectively.Conclusions: In conclusion, our present findings are consistent with apossible effect of the C609T NQO1 inborn polymorphism on MS susceptibility.Additionally, it is suggested that C609T NQO1 and A313G GSTP1polymorphisms are involved in the clinical manifestation of the disease. Thecombined GSTP1 and NQO1 variant genotypes may suggest that defectivefunction of detoxification enzymes might have an effect on MS susceptibility.GSTΜ1 null και ο GSTP1 A313G polymorphisms influence the MS evolution ina gender depended manner. With regard to GSTΤ1 null polymorphismfrequency contribution no significant statistical difference was found betweenthe group of patients and controls.

Εισαγωγή: Η Πολλαπλή Σκλήρυνση (ΠΣ) είναι μία άγνωστης αιτιολογίας,νευροεκφυλιστική, φλεγμονώδης και απομυελινωτική, χρόνια νόσος του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ), που προσβάλλει συνηθέστερα νέους ανθρώπους. Θεωρείται αυτοάνοσης αρχής και χαρακτηρίζεται από πολυεστιακή προσβολή του ΚΝΣ. Παρουσιάζει σημαντική ετερογένεια ως προς την ηλικία έναρξης, τις νευρολογικές εκδηλώσεις, την εξελικτική πορεία και τη βαρύτητα της αναπηρίας. Η νόσος φαίνεται ότι καθορίζεται από συνδυασμό γενετικών και επίκτητων παραγόντων. Κυρίαρχο ρόλο στην αιτιοπαθογένεια της νόσου, όπως προκύπτει από έρευνες, διαδραματίζει το οξειδωτικό στρες. Kατά τη διάρκεια της φλεγμονής σε ασθενείς με ΠΣ παράγονται ελεύθερες ρίζες οξυγόνου, που είναι ιδιαίτερα τοξικές για το κύτταρο. Όταν η ισορροπία μεταξύ της παραγωγής ελευθέρων ριζών και της αντιοξειδωτικής ικανότητας του κυττάρου διαταραχθεί, προκαλείται οξειδωτικόστρες, με τελικό αποτέλεσμα την καταστροφή των μακρομορίων, όπως των μεμβρανικών λιπιδίων, πρωτεινών και νουκλεοτιδίων των αστροκυττάρων. Η αποτοξίνωση τοξικών ουσιών καταλύεται από τα ένζυμα αποτοξίνωσης φάση ςΙ και ΙΙ.Τα σημαντικότερα ένζυμα φάσης ΙΙ είναι τα ένζυμα της οικογένειας S-τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GSTs) και η ρεδουκτάση NQO1. Το κωδικοποιόν γονίδιο GSTP1 παρουσιάζει γενετικό πολυμορφισμό τύπουSNP. Αυτή η (A→G) αντικατάσταση στο νουκλεοτίδιο 313 (A313G), έχει σαν αποτέλεσμα την αντικατάσταση της ισολευκίνης από βαλίνη (Ile105Val). Έτσι,άτομα ομόζυγα ως προς το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο (G/G) έχουν μειωμένη συζευκτική ικανότητα σε σύγκριση με τους ομοζυγώτες για το φυσιολογικό αλληλόμορφο (Α/Α), ενώ οι ετεροζυγώτες A/G παρουσιάζουν μέτρια ενζυματική ενεργότητα. Τα άλλα δύο γονίδια της οικογένειας των τρανσφερασών της γλουταθειόνης (GSTs) Τ1 και Μ1 στον άνθρωπο παρουσιάζουν γενετικό πολυμορφισμό του τύπου ολικής έλλειψης (nullgenotype) με αποτέλεσμα τη θερμική αποσταθεροποίηση και την απώλεια της ενζυμικής τους δράσης. Η ενεργότητα του NQO1 ενζύμου επίσης εξαρτάται από έναν γενετικό πολυμορφισμό του τύπου ενός μόνο νουκλεοτιδίου (SNP)(C609T). Συγκεκριμένα, η αντικατάσταση C→T στη θέση 609 του cDNAοδηγεί στην αντικατάσταση της σερίνης από την προλίνη στο αμινοξύ 187 της πρωτείνης, αποσταθεροποιώντας και απενεργοποιώντας το ένζυμο. Άτομα ετερόζυγα (C/T) για τη μετάλλαξη παρουσιάζουν μειωμένη ενεργότητα του ενζύμου, ενώ άτομα που φέρουν τη μετάλλαξη σε ομόζυγη κατάσταση (T/T),παρουσιάζουν ολική απώλεια της δράσης τους. Σκοπός: Σκοπός της διενέργειας της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση-για πρώτη φορά στον Ελληνικό πληθυσμό- της πιθανής σχέσης των συγκεκριμένων πολυμορφισμών των γονιδίων αποτοξίνωσης GSTP1,GSTM1, GSTT1 και NQO1 με την ΠΣ και τα κλινικά χαρακτηριστικά της.Υλικά και μέθοδοι: Μελετήθηκαν 254 (94 άντρες, 160 γυναίκες) Έλληνες ασθενείς με κλινικά βέβαιη ΠΣ (ομάδα ασθενών) και 370 (188 άντρες και 182γυναίκες) υγιείς μη-συγγενικοί δότες (ομάδα μαρτύρων) αντίστοιχης καταγωγής. Η μέση ηλικία έναρξης της νόσου ήταν τα 35 έτη (18-83 έτη), ενώ η μέση ηλικία των μαρτύρων κατά την παραλαβή του δείγματος ήταν 50 έτη(20-85 έτη). Οι συμμετέχοντες ενημερώθηκαν αναλυτικά για τους σκοπούς και έδωσαν εγγράφως τη συγκατάθεσή τους, ενώ όλη η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιστημονική Επιτροπή του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών. Οι ασθενείς με ΠΣ με βάση την κλίμακα αναπηρίας κατηγοριοποιήθηκαν σε αυτούς με ήπια αναπηρία (EDSS:0-4), με μέτρια(EDSS:4,5-5,5) και σοβαρή (EDSS:6-10). Κλινικά δεδομένα για τον υπότυπο της νόσου ήταν διαθέσιμα για τους 240 από τους 254 ασθενείς. Το σύνολο των ασθενών σύμφωνα με τον κλινικό υπότυπο χωρίστηκε σε τέσσερις υποομάδες, ως εξής: RRMS (Relapsing Remitting MS), RPMS (RelapsingProgressing MS), PPMS (Primary Progressive MS) και SPMS (SecondaryProgressive MS).Ο μοριακός έλεγχος για την ανίχνευση των πολυμορφισμών των υπό μελέτη γονιδίων γίνεται με τεχνικές που στηρίζονται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR). Συγκεκριμένα, η γονοτύπηση των πολυμορφισμών A313G του γονιδίου GSTP1 και C609T του γονιδίου NQO1 πραγματοποιήθηκε με τις μεθόδους PCR-RFLP και PCRπραγματικού χρόνου. Τα γονίδια GSTT1 και GSTM1 παρουσιάζουν πολυμορφισμούς του τύπου της ολικής έλλειψης (null). Η ανίχνευσή τους έγινε με τη μέθοδο πολλαπλού PCR (multiplex PCR).Η στατιστική ανάλυση της κατανομής των γονοτύπων και των λοιπών παραμέτρων που μελετήθηκαν στηρίχθηκε στο Pearson chi-square test. Hστατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο 5% (C.I=95% level, p=0,05).Αποτελέσματα: Οι ετερόζυγοι (C/T) και ιδιαίτερα οι ομόζυγοι (T/T) για τονπολυμορφισμό C609T του γονιδίου NQO1 βρίσκονται πολύ πιο συχνά ανάμεσα στους ασθενείς σε σχέση με τους μάρτυρες. Έτσι, προκύπτει ότι οι ασθενείς με ΠΣ εμφανίζουν 3.7 μεγαλύτερο κίνδυνο να είναι T/T σε σχέση με τους μάρτυρες. Επίσης, ο κίνδυνος για τους ασθενείς να είναι φορείς τουλάχιστον ενός T αλληλίου είναι περίπου 1,5 φορές σε σχέση με τους υγιείς δότες. Η ταξινόμηση των ασθενών με κριτήριο τον κλινικό υπότυπο της νόσου αποκάλυψε μεγαλύτερη συχνότητα των T/T και C/T γονοτύπων στην PPMS(Primary Progressive Multiple Sclerosis) υποομάδα συγκριτικά με τις άλλες.Αυτό επιβεβαιώθηκε και από την υψηλότερη συχνότητα του Τ αλληλομόρφου ανάμεσα στους PPMS. Όσον αφορά στην κατανομή συχνοτήτων των αλληλίων για τον πολυμορφισμό GSTP1 A313G, φαίνεται πως το αλλήλιο Α έχει προστατευτική δράση για τη νόσο στις γυναίκες. Ειδικότερα, οι γυναίκες μάρτυρες εμφανίζουν 1.4 φορές αυξημένο κίνδυνο να φέρουν τουλάχιστον έναA αλλήλιο σε σχέση με τις ασθενείς με ΠΣ. Εκτός από το φύλο ο πολυμορφισμός GSTP1 A313G σχετίζεται και με την κλινική έκφραση της νόσου. Οι ασθενείς με τη μορφή RRMS παρουσιάζουν περισσότερους ετεροζυγώτες Α/G σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Τα αποτελέσματα αυτά προτείνουν έναν πιθανό ρόλο της GSTP1 ετεροζυγωτίας στην έκφραση τουRRMS υπότυπου και επιπλέον με EDSS ≤2 μετά από 10-15 χρόνια από την έναρξη της νόσου. Σε σύγκριση με τους μάρτυρες, στους ασθενείς με ΠΣ παρατηρείται στατιστικά αυξημένη συχνότητα συνδυασμού GSTP1 ετεροζυγωτίας και NQO1 ετεροζυγωτίας ή NQO1 ομοζυγωτίας T/T (Pvalue=0.035, x2=5.33, d.f.=1, OR=0.56, 95% CI=0.345-0.919).Υπάρχει συσχέτιση του πολυμορφισμού GSTΜ1 null με το φύλο, που οι γυναίκες ασθενείς έχουν περίπου 2 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο να έχουνGSTΜ1 null γονότυπο σε σχέση με τους άντρες. Επίσης, οι γυναίκες ασθενείς εμφανίζουν 1,8 φορές μεγαλύτερη επιρρέπεια για τον ίδιο γονότυπο σε σύγκριση με τις γυναίκες μάρτυρες. Συμπεράσματα: Συμπερασματικά, τα ευρήματά μας υποστηρίζουν ότι υπάρχει ισχυρή συσχέτιση του πολυμορφισμού C609T με την πιθανότητα εμφάνισης ΠΣ. Ο ίδιος πολυμορφισμός καθώς και ο GSTP1 A313G φαίνεται ότι επηρεάζουν την κλινική έκφραση της νόσου. Η αυξημένη συχνότητα του συνδυασμού συγκεκριμένων γονοτύπων των GSTP1 και NQO1 πιθανόν συνιστά μία παθολογική λειτουργικότητα των ενζύμων αποτοξίνωσης και ενδεχομένως να έχει επίδραση στον παθογενετικό μηχανισμό της ΠΣ. Ο GSTΜ1 null και ο GSTP1 A313G γονότυποι μεταβάλλουν την εκδήλωση της νόσου σε σχέση με το φύλο. Συνολικά δεν διαπιστώθηκαν διαφορές στα όρια της στατιστικής σημαντικότητας στις δύο ομάδες πληθυσμού αναφορικά με τον GSTΤ1 null πολυμορφισμό. Ωστόσο, το μεγαλύτερο δείγμα πληθυσμού, η ενιαία σχεδίαση των μελετών και η χρήση κοινών μεθοδολογικών παραμέτρων από τις ερευνητικές ομάδες θα ισχυροποιούσε την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων.