Regulation of aldehyde dehydrogenases by nuclear receptors CAR and PXR in rats genetically predetermined in response to phenobarbital

Abstract

The magnitude of the genes belonging to the ALDH superfamily in organism’s welfare andespecially their protection against xenobiotics, as well as the accumulating evidence that indicateinvolvement of nuclear receptors in regulation of many genes including ALDHs, has excited our interestin unraveling the potential role of CAR and PXR in mediation/regulation of ALDH1As subfamily ofgenes, utilizing the unique experimental model of Wistar/Af/Han/Mol/Kuo/Io rats. Specifically, the tworat strains used in this study were either responsive (RR) or non-responsive (rr) to induction ofALDH1A genes after administration of PB (Phenobarbital) or other PB-type inducers.The apparent difference of ALDH1As induction between the two strains, both at basal levelsand after treatment with PB or PCN, which was detected with protein immunoprecipitation experiments,was further investigated at mRNA levels of expression. The results revealed that the remarkabledifference was attributed to the complete absence of ALDH1A7 expression in rr strain. Furthermore, astriking up-regulation of the gene was observed in RR rats in the presence the above drugs, which act as selective agonists for the nuclear receptors CAR and PXR. Concurrently, expression of ALDH1A1gene was only slightly higher in rr rats, compared to respective expression levels in RR animals.Supportive evidence to our findings was displayed in experiments of ontogenesis with liver samplesderived from neonates and corresponding in vitro studies in primary hepatocyte cultures.The nuclear translocation of CAR and PXR upon treatment with their selective agonists wasevident in both rat strains and also time- and dose-dependent, however their potential gene activationhad to be further tested by studying the induction of their well-studied target genes; CYP2B1 andCYP3A1, respectively.Focusing on the tremendous difference of ALDH1A7 expression between the strains and theuncontest effect of drugs in transcription regulation, we performed reporter gene assays with variousdeletion constructs of RR-ALDH1A7 and rr-ALDH1A7 promoters, as well as chromatinimmunoprecipitation assays on the same promoter regions. Interestingly, our results indicated RRALDH1A7as an active promoter highly-upregulated in response to PB administration, which is instrong contrast to the barely active rr-ALDH1A7. Although the proximal promoter is the essentialregion for turning on gene transcription, we nominated a region of the RR-ALDH1A7 promoter between-1566 to -452,which demonstrated highest activation potential.CAR was emerged as a substantial regulator of RR-ALDH1A7 gene activation, especially whenPB or other CAR-activators were administered. In RR-ALDH1A7, CAR was found to bind to the distalpromoter of the gene, serving as enhancer of gene expression, and presumably PXR may also be ableto bind, since the receptors are promiscuous to their binding to targets and cross-talk to each other.

H σπουδαιότητα των ενζύμων που ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των αλδεϋδικών αφυδρογονασών (ALDHs) στην ευζωία των οργανισμών και κυρίως στην προστασία τους από ξενοβιοτικούς παράγοντες, καθώς και η συσσώρευση στοιχείων που υποδηλώνουν την εμπλοκή πυρηνικών υποδοχέων στην ρύθμιση της έκφρασης πολλών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων τωναλδεϋδικών αφυδρογονασών, κέντρισε το ενδιαφέρον μας να αποκαλύψουμε τον πιθανό ρόλο των υποδοχέων CAR και PXR στην επαγωγή/ρύθμιση των ALDHs της υπο-οικογένειας 1Α, αξιοποιώντας το ιδιαίτερο πειραματικό μοντέλο των επίμυων του γένους Wistar/Af/Han/Mol/Kuo/Io. Συγκεκριμένα, ταδυο στελέχη των επίμυων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη χαρακτηρίζονται ως αποκρινόμενα (RR) ή μη-αποκρινόμενα (rr) ως προς την επαγωγή των γονιδίων ALDH1A, μετά την χορήγηση φαινοβαρβιτάλης (ΡΒ) ή άλλων ΡΒ τύπου επαγωγέων. H προφανής διαφορά στην επαγωγή των ALDH1As μεταξύ των δύο στελεχών, που ανιχνεύτηκε με πειράματα μελέτης των πρωτεϊνών, τόσο σε βασικά επίπεδα έκφρασης όσο και μετά τηχορήγηση φαινοβαρβιτάλης (PB) ή καρβονιτριλίου της πρεγνενολόνης (PCN), διερευνήθηκε περαιτέρω με μελέτη των επιπέδων παραγωγής mRNA. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η αξιοσημείωτη διαφορά οφείλεται στην παντελή έλλειψη έκφρασης του γονιδίου ALDH1A7 στο στέλεχος rr. Επίσης,παρατηρήθηκε εντυπωσιακή αυξο-ρύθμιση στους RR επίμυες, ιδιαίτερα παρουσία των παραπάνω φαρμάκων, τα οποία δρουν ως εκλεκτικοί αγωνιστές των πυρηνικών υποδοχέων CAR και PXR.Παράλληλα, η έκφραση του γονιδίου ALDH1A1 βρέθηκε λίγο υψηλότερη στους rr επίμυες, συγκριτικά με τα αντίστοιχα επίπεδα στο RR στέλεχος. Αποτελέσματα που υποστηρίζουν τα παραπάνω στοιχεία προέκυψαν και από πειράματα οντογένεσης που πραγματοποιήθηκαν σε ήπαρ από νεογέννητους επίμυες, αλλά και σε αντίστοιχη in vitro μελέτη πρωτογενών καλλιεργειών ηπατοκυττάρων. Η μετακίνηση των υποδοχέων CAR και PXR στον πυρήνα των κυττάρων, μετά την χορήγηση των εκλεκτικών αγωνιστών τους ήταν εμφανής και στα δύο στελέχη των επίμυων, και επίσης ήταν χρονο- και δόσο-εξαρτώμενη. Ωστόσο, η ικανότητά τους να ενεργοποιούν την έκφραση γονιδίων μελετήθηκε περαιτέρω, με μέτρηση της επαγωγής γνωστών γονιδίων στόχων τους: των κυτοχρωμάτωνCYP2B1 και CYP3A1, αντίστοιχα.Εστιάζοντας στην σημαντικά υψηλή διαφορά μεταξύ των δύο στελεχών ως προς την έκφραση της ALDH1A7 και την αδιαμφισβήτητη επίδραση των παραπάνω φαρμάκων στην ρύθμιση της έκφρασης, πραγματοποιήσαμε δοκιμασίες μέτρησης γονιδίου αναφοράς, χρησιμοποιώντας διάφορα τμήματα των υποκινητών του γονιδίου, προερχόμενα από τα δύο στελέχη (RR-ALDH1A7 και rrALDH1A7).Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες ανοσοκαθίζησης της χρωματίνης στα παραπάνω τμήματα των υποκινητών. Ιδιαίτερα ενδιαφέρον ήταν το εύρημα ότι ο υποκινητής RRALDH1A7 είναι ενεργός και μάλιστα η ενεργότητά του αυξάνεται δραστικά σε περίπτωση χορήγησης ΡΒ, γεγονός το οποίο είναι σε πλήρη αντίθεση με την ελάχιστη ενεργότητα που επέδειξε ο υποκινητής rr-ALDH1A7. Παρ’ όλο που ο η περιοχή του υποκινητή που βρίσκεται κοντά στην αρχή του γονιδίου είναι η πιο σημαντική για την ενεργοποίηση της έκφρασης, βρέθηκε ότι η περιοχή του υποκινητή RRALDH1A7 που βρίσκεται μεταξύ -1566 και -452 είναι υπεύθυνη για την μέγιστη ενεργότητα. O πυρηνικός υποδοχέας CAR αναδεικνύεται ως κύριος ρυθμιστής της έκφρασης του γονιδίου RR-ALDH1A7, ιδιαίτερα μετά την χορήγηση PB ή άλλων αγωνιστών του CAR. Ειδικότερα στο γονίδιο RR-ALDH1A7 ο CAR βρέθηκε ότι προσδένενται στον υποκινητή μακριά από την θέση έναρξης της μεταγραφής, δρώντας κυρίως ως ενισχυτής της έκφρασης του γονιδίου, και πιθανότατα και ο PXR να δύναται να προσδεθεί, δεδομένου ότι οι δύο υποδοχείς συχνά ανταλλάσουν τις θέσεις πρόσδεσής τους στα γονίδια-στόχους και αλληλεπιδρούν μεταξύ τους