Απομόνωση, επέκταση και ελεγχόμενη διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων του ομφαλοπλακουντιακού αίματος και του ομφάλιου λώρου: κλινικές εφαρμογές ιστικής ανάπλασης

Abstract

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a special class of stem cells: in addition to their ability of self-renewal and their differentiation capacity into cells of mesodermal (mainly) origin, they exhibit an in vivo immunnomodulatory activity. It is therefore considered that MSCs could contribute to clinical applications of regenerative medicine and advanced cellular therapies. However, it has been shown that stem cells isolated from adult tissues, are "aged" and thus show decreased proliferative capacity and limited functionality.The aim of this thesis was to determine whether the umbilical cord blood and umbilical cord tissue, could serve as sources of MSCs for clinical applications.During this study, cells isolated from the umbilical cord blood by gradient centrifugation, either with or without prior enrichment of the MSCs population using the commercial formulation RosetteSep, as well as cells isolated from the umbilical cord tissue following enzymatic digestion (collagenase and hyaluronidase) or explant cultures, were extensively cultured in different conditions. Specifically, two different culture media were tested: a commercial kit for culturing MSCs and α-MEM supplemented with either animal fetal bovine serum or with human cord blood serum. For the phenotypic characterization of MSCs, their immune phenotype was checked using flow cytometry and the expression of pluripotence genes was verified by reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR). In parallel, the cells differentiation potential was evaluated through culture in media inducing osteogenesis, adipogenesis and chondrogenesis. The differentiated cells were detected using the appropriate staining. In a second time, we studied the effect of freezing of umbilical cord MSCs, at different intervals of cryopreservation. The characteristics and properties of the cryopreserved cells were evaluated with the aforementioned methods. Finally, we investigated the possibility of populating collagen scaffolds with MSCs in cell-scaffold co-cultures under static and dynamic conditions.From the analysis of the results:-It became apparent that MSCs exist in cord blood but their systematic isolation is impossible with the methods available at the moment. We believe that this finding, based on the largest sample (268 cord blood units) studied to date, finally clarified the cloudy landscape which had arisen from previously published studies (in small samples) with conflicting results.-We confirmed the ease of MSCs isolation from umbilical’s cord Wharton’s. These cells exhibit differences in their ability to differentiate with respect to those of adults, differences, related to their foetal origin and their "young" age.-We used for the first time umbilical cord MSCs to colonize collagen scaffolds and showed that these cells could be used as an alternative for tissue engineered constructs, insofar based on the supply of more “aged” adult MSCs.-We, designed, studied and validated an isolation and cryopreservation protocol of these cells, with a view to their future use for clinical applications, thus enabling the creation of the first Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Bank, in the Biomedical Research Foundation, Academy of Athens.-It was shown that culturing foetal mesenchymal stem cells can achieved without the use of animal sera, using as a substitute, for the first time, the cord blood serum.

Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) αποτελούν μία ιδιαίτερη κατηγορία βλαστικών κυττάρων, καθώς επιπλέον της ιδιότητάς τους να αυτοανανεώνονται και να διαφοροποιούνται σε κύτταρα μεσοδερμικής, κυρίως, προέλευσης, παρουσιάζουν και ανοσορρυθμιστική δράση in vivo. Θεωρείται κατά συνέπεια ότι θα μπορούσαν να συμβάλλουν σε κλινικές εφαρμογές αναγεννητικής Ιατρικής και σε προηγμένες κυτταρικές θεραπείες. Έχει ωστόσο αποδειχθεί ότι τα βλαστικά κύτταρα που απομονώνονται από ιστούς ενηλίκων οργανισμών, είναι «γηρασμένα», παρουσιάζουν μειωμένη πολλαπλασιαστική ικανότητα και περιορισμένη λειτουργικότητα. Σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής ήταν να διαπιστωθεί κατά πόσο το ομφαλοπλακουντιακό αίμα και ο ιστός του ομφαλίου λώρου, θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως πηγές MSCs για κλινικές εφαρμογές. Για την πραγματοποίηση της μελέτης, κύτταρα που απομονώθηκαν από το ομφαλοπλακουντιακό αίμα με επιστίβαση, αφού είχε προηγηθεί εμπλουτισμός του πληθυσμού των MSCs με τη χρήση εμπορικού σκευάσματος RosetteSep αλλά και χωρίς εμπλουτισμό, καθώς και κύτταρα που απομονώθηκαν από τον ομφάλιο λώρο με ιστοκαλλιέργειες ή ενζυματική πέψη (με κολλαγενάση και υαλουρονιδάση) καλλιεργήθηκαν εκτεταμένα σε διαφορετικές συνθήκες. Συγκεκριμένα, εξετάστηκαν δύο διαφορετικά θρεπτικά υλικά: ένα εμπορικό κιτ για την καλλιέργεια MSCs και το α-ΜΕΜ συμπληρωμένο είτε με τον ζωικό ορό εμβρύου βοός είτε με ανθρώπινο ορό ομφαλοπλακουντιακού αίματος. Για το φαινοτυπικό χαρακτηρισμό των MSCs ελέγχθηκε ο ανοσοφαινότυπός τους με κυτταρομετρία ροής καθώς και η έκφραση γονιδίων πολυδυναμικότητας των βλαστικών κυττάρων με αντίστροφη μεταγραφή και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Παράλληλα μελετήθηκε η ιδιότητα διαφοροποίησής τους με την καλλιέργειά τους σε θρεπτικά υλικά που επάγουν την οστεογένεση, τη λιπογένεση και τη χονδρογένεση. Τα διαφοροποιημένα κύτταρα ανιχνεύθηκαν με τη βοήθεια των κατάλληλων χρώσεων. Σε ένα δεύτερο χρόνο επιχειρήθηκε η κρυοσυντήρηση των MSCs του ομφαλίου λώρου εξετάζοντας την επίδραση της κατάψυξης, σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα, στα χαρακτηριστικά και τις ιδιότητες των κυττάρων που είχαν απομονωθεί από τον ομφάλιο λώρο με τις προαναφερθείσες μεθόδους. Τέλος μελετήθηκε η δυνατότητα επικοισμού ικριωμάτων κολλαγόνου από MSCs του ομφαλίου λώρου με συγκαλλιέργειά τους τόσο σε στατικές όσο και δυναμικές συνθήκες. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων: -Προέκυψε ότι MSCs υπάρχουν στο ομφαλοπλακουντιακό αίμα αλλά η συστηματική απομόνωσή τους είναι ανέφικτη με τις μεθόδους που διαθέτουμε αυτή τη στιγμή. Θεωρούμε ότι η διαπίστωση αυτή, στο μεγαλύτερο δείγμα (268 μονάδες ομφαλοπλακουντιακού αίματος) που έχει χρησιμοποιηθεί έως σήμερα, ξεκαθάρισε οριστικά το νεφελώδες τοπίο το οποίο είχε προκύψει από δημοσιεύσεις μελετών (σε μικρά δείγματα) με αντικρουόμενα αποτελέσματα. -Διαπιστώθηκε η ευκολία απομόνωσης MSCs από τη Βαρτόνειο γέλη του ομφαλίου λώρου. Τα κύτταρα αυτά παρουσιάζουν διαφορές στη δυνατότητα διαφοροποίησής τους σε σχέση με αυτά των ενηλίκων, διαφορές οι οποίες σχετίζονται με την εμβρυική προέλευσή τους και την «νεαρή» τους ηλικία. -Αποδείχθηκε ότι τα MSCs του ομφαλίου λώρου μπορούν να αποικήσουν ικριώματα κολλαγόνου και θα μπορούσαν πιθανότατα να χρησιμοποιηθούν ως εναλλακτική λύση των κατασκευών ιστομηχανικής που έως τώρα στηρίζονται αποκλειστικά στην προμήθεια πιο «γηρασμένων» MSCs από ιστούς ενηλίκων. -Σχεδιάσθηκε μελετήθηκε και επικυρώθηκε ένα πρωτόκολλο απομόνωσης και κρυοσυντήρησης των κυττάρων αυτών με σκοπό τη μελλοντική τους χρήση για κλινικές εφαρμογές, γεγονός που επέτρεψε τη δημιουργία της πρώτης Τράπεζας Μεσεγχυματικών Κυττάρων του ομφαλίου λώρου στο Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών. -Διαπιστώθηκε ότι η καλλιέργεια εμβρυικών μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων μπορεί να γίνει χωρίς τη χρήση ζωικών ορών, χρησιμοποιώντας, για πρώτη φορά, ως υποκατάστατο τον ορό ομφαλοπλακουντιακού αίματος.