Ανάπτυξη και επικύρωση υπερ-ευαίσθητων συνοδών διαγνωστικών εξετάσεων στα πλαίσια της υγρής βιοψίας (κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα και ελεύθερο-κυττάρων DNA)

Abstract

During the last years, liquid biopsy has overcome the limitations of tumor biopsy, changinh significantly the therapeutic strategy in cancer patients. Liquid biopsy is based on the analysis of circulating tumor cells (CTCs) and circulating tumor DNA (ctDNA). Personalised medicine is based on the clinical evaluation of tumor biomarkers (DNA mutations, epigenetic alterations etc), which create a unique genetic profile of the patient and provides the right treatment to the patient on the right timeIn the present PhD thesis, we initially evaluated the presence of PIK3CA hotspot mutations in plasma-ctDNA samples from patients with early and metastatic breast cancer using a highly sensitive and analytically validated methodology based on the combination of of allele-specific, asymmetric rapid PCR and melting curve analysis. Moreover, a direct comparison study of PIK3CA hotspot mutations was performed in DNAs isolated from CellSearch® cartridges and paired plasma-ctDNA in identical blood draws using the same methodology in early and metastatic breast cancer patients. The results of our study were compared with the results based on ddPCR and a high concordance between our assay and ddPCR was demonstrated.Furthermore, we developed four novel assays for the detection of ESR1 mutations (Y537C, Y537N, Y537S, D538G), in liquid biopsy samples. This methodology is based on the combination of allele-specific, asymmetric rapid PCR and melting curve analysis. The clinical validation of this methodology was performed in DNAs isolated from CTCs of CellSearch® cartridges from metastatic ER(+) breast cancer patients. The results showed that ESR1 mutations were identified at high percentages in cases where detactable CTCs were identified by the CellSearch® system.We additionally performed a direct comparison study between droplet digital PCR and a combination of allele-specific PCR, asymmetric rapid PCR and melting curve analysis for the detection of BRAF V600E mutation in plasma from melanoma patients. The overall agreement between these two methodologies was very high, indicating that both assays are suitable for the assessment of circulating BRAF-mutant ctDNA. High overall agreements were demonstrated when comparing the detection of BRAF V600E mutation in plasma using both methods with tissue testing. Half of the clinical samples which were BRAF V600E tumor positive were found to be positive in matched plasma-ctDNA samples for the same mutation. Interestingly, our study revealed a dependence of the correctness of plasma-based genotyping results on the sample storage duration highlighting the impact of pre-analytical factors.Finally, we developed and clinically validated a highly sensitive and specific RT-qPCR assay for the detection of PIM-1 mRNA expression in CTCs. Using this assay, we detected PIM-1 overexpression at a high frequency in EpCAM(+) fractions of metastatic castration resistant prostate cancer patients (mCRPC). Our data showed for the first time that detection of CTCs overexpressing PIM-1 is feasible, suggesting PIM-1 as a potential biomarker for prostate cancer management.

Τα τελευταία χρόνια, η προσέγγιση της "υγρής βιοψίας" (liquid biopsy) έρχεται να υπερκεράσει τους περιορισμούς της βιοψίας του όγκου αλλάζοντας σημαντικά τη θεραπευτική στρατηγική σε ασθενείς με καρκίνο. Η «υγρή βιοψία», βασισμένη στην ανάλυση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (Circulating Tumor Cells, CTCs) και του εξωκυττάριου καρκινικού DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) παρέχει μία μη-επεμβατική παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου και της αποτελεσματικότητας της θεραπείας, σε πραγματικό χρόνο. Οι DNA μεταλλάξεις δημιουργούν ένα ξεχωριστό γενετικό προφίλ στον ασθενή και στο οποίο η εξατομικευμένη ιατρική στηρίζεται, ώστε να παρέχει τη σωστή θεραπεία στον ασθενή τη σωστή χρονική στιγμή.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αρχικά αξιολογήθηκε η παρουσία των PIK3CA μεταλλάξεων σε δείγματα ctDNA ασθενών με πρώιμο και μεταστατικό καρκίνο μαστού χρησιμοποιώντας μια εξαιρετικά ευαίσθητη και αναλυτικά επικυρωμένη μεθοδολογία που βασίζεται στον συνδυασμό αλληλοειδικής ασύμμετρης PCR και ανάλυσης καμπυλών τήξης. Ακόμα, διεξήχθει άμεση σύγκριση της παρουσίας των PIK3CA μεταλλάξεων σε δείγματα DNA που απομονώθηκαν από CellSearch® cartridges και από το αντίστοιχο πλάσμα ασθενών με πρώιμο και μεταστατικό καρκίνο μαστού. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της μελέτης επικυρώθηκαν με την μεθοδολογία της ddPCR, καταγράφοντας υψηλή συμφωνία μεταξύ των δυο μεθοδολογιών.Στη συνέχεια, αναπτύχθηκαν τέσσερις νέες μεθοδολογίες για την ανίχνευση των ESR1 μεταλλάξεων (Y537C, Y537N, Y537S, D538G) σε δείγματα υγρής βιοψίας. Η εν λόγω μεθοδολογία βασίζεται στον συνδυασμό αλληλοειδικής ασύμμετρης PCR και ανάλυσης καμπυλών τήξης. Η κλινική επικύρωση αυτών των προσδιορισμών πραγματοποιήθηκε σε δείγματα DNA που απομονώθηκαν από τα CTCs των CellSearch® cartridges ασθενών με μεταστατικό ER(+) καρκίνο μαστού. Τα αποτελέσματα έδειξαν την ανίχνευση των ESR1 μεταλλάξεων σε υψηλό ποσοστό σε δείγματα στα οποία υπήρχαν ανιχνεύσιμα CTCs σύμφωνα με το σύστημα CellSearch®.Επιπρόσθετα, διεξήχθει άμεση σύγκριση των επιδόσεων δύο εξαιρετικά ευαίσθητων μεθοδολογιών, της ddPCR και ενός συνδυασμού αλληλοειδικής, ασύμμετρης PCR και ανάλυσης καμπυλών τήξης για την ανίχνευση της μετάλλαξης BRAF V600E στα ίδια δείγματα ctDNA πλάσματος σε ασθενείς με μελάνωμα. Η συνολική συμφωνία μεταξύ αυτών των δύο μεθοδολογιών ήταν πολύ υψηλή, υποδεικνύοντας ότι οι προσδιορισμοί δίνουν συγκρίσιμα αποτελέσματα για την αξιολόγηση του προφίλ της μετάλλαξης στο πλάσμα. Υψηλά ποσοστά συμφωνίας παρατηρήθηκαν όταν συγκρίθηκε η ανίχνευση της μετάλλαξης BRAF V600E στο πλάσμα χρησιμοποιώντας και τις δύο μεθόδους με την ιστική ανάλυση. Τα μισά από τα κλινικά δείγματα τα οποία ήταν BRAF V600E θετικά στα δείγματα ιστού, βρέθηκαν να είναι θετικά και στα αντίστοιχα δείγματα ctDNA πλάσματος για την ίδια μετάλλαξη. Είναι ενδιαφέρον ότι η εν λόγω μελέτη έδειξε μια επίπτωση στην ορθότητα των αποτελεσμάτων της ανάλυσης με βάση το πλάσμα στη διάρκεια της αποθήκευσης του δείγματος υπογραμμίζοντας την επίδραση των προ-αναλυτικών παραγόντων.Στο τελευταίο μέρος της διατριβής, αναπτύχθηκε, επικυρώθηκε και αξιολογήθηκε μια εξαιρετικά ευαίσθητη RT-qPCR μεθοδολογία για την mRNA έκφραση του γονιδίου PIM-1 σε EpCAM(+) κλάσμα περιφερικού αίματος ασθενών με μεταστατικό ευνουχοάντοχο καρκίνο προστάτη (mCRPC). Η υπερέκφραση του PIM-1 σε EpCAM(+) κλάσμα ανιχνεύθηκε σε υψηλό ποσοστό. Τα δεδομένα μας δείχνουν για πρώτη φορά την υπερέκφραση του PIM-1 σε CTCs, καταδεικνύοντας τη χρήση αυτού του μορίου ως πιθανό βιοδείκτη για τη διαχείριση του καρκίνου του προστάτη. Περαιτέρω έρευνα σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων καθίσταται αναγκαία, προκειμένου να αποδειχτεί η κλινική χρησιμότητα του βιοδείκτη.