Identification and functional characterization of RNA silencing key-genes in the model pennate diatom species Phaeodactylum tricornutum

Abstract

Gene silencing, also known as RNA interference (RNAi), is a conserved mechanism of regulation of gene expression mediated by small RNAs (sRNA), (Fire et al., 1998). Silencing of transgenes and endogenous genes following introduction of inverted repeats, antisense constructs and artificial miRNAs has been reported in diatom species, including the model species P. tricornutum (De Riso et al., 2009; Kaur and Spillane, 2015). The presence of an endogenous RNAi pathway has been suggested after comprehensive and combinatorial analyses of sRNAs, gene expression and DNA methylation in P. tricornutum (Veluchamy et al., 2013; Rogato et al., 2014). This RNAi pathway in P. tricornutum may play a role in the regulation of protein coding genes and TEs expression with possible consequences for the acclamatory response to nutrient limitation (Maumus et al., 2009). Homologues of the RNAi-key genes DICER (DCR), ARGONAUTE (AGO) and RNA-Dependent RNA polymerase (RDR) have been previously identified by in silico analysis (De Riso et al., 2009). However, the validation of their gene models, the characterization of their functions and the possible physiological role of RNAi in diatoms are still lacking. In this study, extensive in silico analysis of genomic and transcriptomic information available in P. tricornutum suggests the presence of a single PtDCR, PtAGO and PtRDR coding gene. Mining and phylogenetic analysis of DCR, AGO and RDR homologues in diatoms from all publically available to date sequence datasets suggest an unanticipated diversification of the RNAi pathway in these organisms. PtDCR/AGO/RDR cDNA were cloned and splicing isoforms of PtDCR and PtAGO were identified. Subcellular localization of PtDCR-/AGO-/RDR-YFP was investigated by confocal microscopy. Functional characterization of PtDCR and PtAGO was first attempted by heterologous expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae and the plant Nicotiana bethamiana hosts. In a second step, CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis approach, recently developed in P. tricornutum, was successfully harnessed to generate PtDCR-KO and PtAGO-KO (KnockOut) lines. Growth phenotype of PtDCR-KO lines were investigated under optimal and nitrate depleted culture conditions and during recovery from UV-mediated stress. In parallel, mRNA and small RNAs whole transcriptome analyses were carried out. Culture experiments suggest that PtDCR may play a role in the response to nitrate starvation. Transcriptomic analysis revealed that both sRNA and mRNA transcriptomes were affected in PtDCR-KO line. At the global scale, sRNA size distribution was found to shift towards larger fragment size in PtDCR-KO line. In addition, the abundance of sRNA mapped to TEs was found dramatically reduced in PtDCR-KO mutant and a concomitant increase in mRNA abundance of some TEs was observed. Interestingly, PtDCR-KO sRNA transcriptome also presented changes in tRNA-derived sRNA populations, suggesting a possible role of DCR in their processing in diatoms. TE mobilization has been proposed to play a pivotal role in diatom species diversification and capacity for adaptation to various environments. Taken together, our results indicate that the single DCR encoding gene present in P. tricornutum plays a major role in the production of TE-derived sRNAs and possibly TE mobilization, with important consequences for diatom acclamatory response and evolution.

Ο μηχανισμός της RNA Σίγησης, γνωστός και ως μονοπάτι RNA παρεμβολής (RNA interference, RNAi), αποτελεί ένα συντηρημένο μηχανισμό ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης με τη διαμεσολάβηση μικρών RNA μορίων (sRNA), (Fire et al., 1998). Στα διάτομα, και στο διάτομο οργανισμό μοντέλο Phaeodactylum tricornutum, έχει παρατηρηθεί η σίγηση εξωγενών και ενδογενών γονιδίων μετά την εισαγωγή ανάστροφων επαναλήψεων, συμπληρωματικών μεταγράφων και τεχνητών miRNAs (De Riso et al., 2009; Kaur and Spillane, 2015). Στο P. tricornutum έχει προταθεί η παρουσία ενός ενδογενούς RNAi μονοπατιού μετά από μελέτες των sRNAs, της γονιδιακής έκφρασης και της μεθυλίωσης DNA του (Veluchamy et al., 2013; Rogato et al., 2014). Αυτό το RNAi μονοπάτι μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και μεταθετά στοιχεία (Transposable Elements,TEs) και πιθανώς να επηρεάζει την απόκριση προσαρμογής σε συνθήκες περιορισμένων θρεπτικών (Maumus et al., 2009). Ομόλογα των βασικών RNAi γονιδίων DICER (DCR), ARGONAUTE (AGO) και RNA-Dependent RNA polymerase (RDR) έχουν αναγνωριστεί με ανάλυση in silico (De Riso et al., 2009). Ωστόσο, η εξακρίβωση του γονιδιακού μοντέλου τους, ο χαρακτηρισμός της λειτουργίας τους και ο ρόλος τους σε επίπεδο φυσιολογίας παραμένουν άγνωστα. Στην παρούσα διατριβή, επιβεβαιώνεται η ύπαρξη ενός μοναδικού γονιδίου PtDCR, PtAGO και PtRDR στο P. tricornutum μετά από εκτεταμένη ανάλυση in silico των διαθέσιμων γονιδιωματικών και μεταγραφικών δεδομένων του. Η ανεύρεση και φυλογενετική ανάλυση των DCR, AGO και RDR ομόλογων γονιδίων στα διάτομα από όλες τις διαθέσιμες βάσεις δεδομένων παρουσιάζουν μια μη αναμενόμενη διαφοροποίηση του RNAi μονοπατιού σε αυτούς τους οργανισμούς. Το cDNA των PtDCR/AGO/RDR κλωνοποιήθηκε και αναγνωρίστηκαν μετάγραφα εναλλακτικού ματίσματος των PtDCR και PtAGO. Ο υποκυτταρικός εντοπισμός των PtDCR-/AGO-/RDR-YFP διερευνήθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία. Για τον χαρακτηρισμό της λειτουργίας των PtDCR και PtAGO γονιδίων δοκιμάστηκε αρχικά η έκφρασή τους στα ετερόλογα συστήματα της ζύμης Saccharomyces cerevisiae και του φυτού Nicotiana bethamiana. Στη συνέχεια, με την εφαρμογή της CRISPR/Cas9-καθοδηγούμενης μεταλλαξιγένεσης, πρόσφατα προσαρμοσμένη στο P. tricornutum, δημιουργήθηκαν επιτυχώς οι μεταλλαγμένες σειρές με εκτοπισμό PtDCR-KO και PtAGO-KO (KnockOut). Η μελέτη του φαινοτύπου στην ανάπτυξη των PtDCR-KO σειρών έγινε σε καλλιέργειες υπό φυσιολογικές συνθήκες, υπό συνθήκες περιορισμένων νιτρικών και μετά από UV-επαγόμενο στρες. Παράλληλα, διεξήχθη αλληλούχιση νέας γενιάς (NGS) και ανάλυση των ολικών μεταγράφων mRNA και small RNAs. Τα πειράματα των καλλιεργειών υποδεικνύουν ότι η PtDCR ίσως παίζει ρόλο στην απόκριση υπό την έλλειψη νιτρικών. Η μεταγραφική ανάλυση αποκάλυψε ότι και τα sRNA και τα mRNA μετάγραφα επηρεάστηκαν στη DCR-KO σειρά. Συνολικά, η κατανομή του μεγέθους των sRNA μετατοπίστηκε προς μεγαλύτερου μεγέθους μόρια στην PtDCR-KO σειρά. Επίσης, ο αριθμός των sRNA που εντοπίζονται σε TEs ήταν δραματικά μειωμένος στη PtDCR-KO σειρά και παρατηρήθηκε μία συνακόλουθη αύξηση του αριθμού των mRNA κάποιων TEs. Ενδιαφέρον παρουσιάζει ότι στα PtDCR-KO sRNA μετάγραφα παρατηρούνται επίσης αλλαγές στους tRNA-παραγόμενους sRNA πληθυσμούς υποδεικνύοντας ένα πιθανό ρόλο της DCR στην επεξεργασία αυτών των μορίων στα διάτομα. Έχει προταθεί ότι η κινητοποίηση των TE παίζει σημαντικό ρόλο στη εξελικτική διαφοροποίηση των διατόμων και στην ικανότητά τους για γρήγορη απόκριση και προσαρμογή σε ποικίλα περιβάλλοντα. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτής της διατριβής δείχνουν ότι το μοναδικό γονίδιο DCR στο P. tricornutum παίζει σημαντικό ρόλο στην παραγωγή των TE-παραγόμενων sRNAs και πιθανά στην κινητοποίηση των TEs, επηρεάζοντας σημαντικά την απόκριση προσαρμογής των διατόμων και την εξέλιξή τους.